基质效应问题

基质效应问题一直是我们遇到的大问题，刚看到了，想和大家交流一下，我的几点建议是：
1）最好是优化前处理方案，从根本上解决基质效应问题。如果是液液萃取，改用提取效率更高的提取剂；如果SPE估计关系不大；如果蛋白沉淀，更高的沉淀或稀释倍数，一般不建议改用无机盐，但得根据实际需要。另外，牵涉灵敏度能否达到的问题。
2）优化色谱条件，一般的基质抑制主要是前沿峰里的混合物质，最好是检测物与前沿峰完全分离。当然了，可以增加一些提高信噪比的物质，这些需根据离子化加合的物质选择。也可以使用梯度洗脱，既可以减少前沿基质，又能提高信噪比。
3）当然了，有些仪器可以通过特殊的方法专门考察一下基质效应所引响的区域，从三通阀处用针泵恒速进样检测物，用液相进样含基质的空白基质处理液，检测会看到基质抑质的倒峰。
4）优化离子源参数，以实际响应的提高为标准。
6）对于内源性基质抑制就很难处理了，要一步步去寻找根源和减少抑制。

我最近遇到内源性物质（估计是代谢物）对自身的影响，很难办，出在头痛中。希望大家多出主意，多讨论！ :D

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查到的基质效应的相关知识

1 、基质（matrix） 尚无统一的解释，曾称为“一种分析物（analyte）的环境（milieu）”，即指标本中除分析物以外的一切组成。以血清胆固醇（Chol）测定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化学性质。

2、基质效应（matrix effect） 按NCCLS文件的定义，指

（1）标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。

（2）基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。


3、基质偏差（matrix bias） 基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差。 用作校准物质或质控物的经过处理的混合血清，由于血清基质的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。 基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。

4、制备物（processed material） 用于血脂常规测定的校准液（calibrator）及用于技能对比试验（proficiency test，PT）或室间质量评价（EQA）的样品（如质控血清）。 以Chol测定为例，全酶法测Chol始于1974年，在此以前用化学反应测Chol时，除了一些已知的干扰因素外尚未提及基质效应问题。1979年才由Cooper指出Chol酶法中校准液与病人血清的反应性不同，可使Chol测定值偏低5%～7%。 1994年CAP调查570实验室时用了参考方法定值的新鲜冰冻血清为调查材料，15个同方法测定chol组中仍有11个组出现基质偏差，同时用制备物的4个组中，3个有基质偏差。 有的报告指出TG、HDL-C常规方法与CDC的参考方法比较，有明显偏差，甚至>10%。McNamura等发现血清冰冻可在免疫法（用apoAI与E抗体分离LDL）直接测定LDL-C时出现明显基质效应，血清冰冻保存2～26周后，LDL-C测定值平均偏低10%左右。 由于新鲜血清与冻干血清的apoAI测定值一致，显示冻干对apoAI测定不产生基质效应，故apoAI参考血清以冻干形式提供。但冻干对apoB有极明显的影响，在不同原理的免疫法中，基质偏差高达-26%～+4%，但这种变化也包括apoB分子本身的结构变化在内。所以apoB参考血清是液态冰冻保存的。

5、减少基质效应的方法 ： Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。 改进仪器设计及试剂组成。 选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。

      瞬间离子基体效应 moment ion matrix effect 离子的有效淌度受到周围离子的影响，由其周围离子所形成的包围圈，称为离子基体。如果样品组分从进样点到探测点迁移过程中，在某一时间间隔遇上一个不同组成的基体区带，这个离子基体区带就将对样品组分产生影响，使它们的淌度发生瞬时变化，从而选择性地影响溶质的迁移和分离，这就是瞬时离子基体效应。

基质效应的评价

医学和实验室职业团体以及公众，对生物液体测试准确度的关注增加了。适当的规则意味着提高了测试步骤的准确度。重新强调了在临床，参考和医生的官方实验室，用外部质量评价方案（EQAS）和内部测试（PT）来评价和监测测试的准确度的重要。

目前的科学数据表明，由于基质效应，存在于许多外部控制材料中，这样的EQAS结果的使用并非总是可行的。这些处理过的材料（包括质量控制和定标材料）有时的表现不同于实验室日常分析的新鲜样本。新鲜的生物液体没有产生的偏差，在EQAS，控制和定标材料中经常见到。由于这些基质效应，用PT评价实验室测试准确度的性能可能导致不准确的结论和可能的不恰当管理批准。

基质效应现象与分析测试中四种主要组成部分的相互作用有关：仪器设计，试剂配方，方法原理，控制，定标和PT材料的成分及处理技术。这些类别中的每一种都是对偏差的大小和方向（正向或负向）有贡献的因素。引起基质效应的相互作用是复杂的，并且由于学科（化学，血液学）和每种方法用于定标和监测特性的材料的本性不同而不同。可以料想到细胞悬浮液的性能特征与去蛋白滤过液不同。

需要进行研究来定性这些干扰因素，以便设计仪器，试剂和液体最小化这些干扰。在那以前，方法的标准化和实验室测试准确度的评价和监测是困难的。

本文件是EP7-临床化学的干扰测试的补充。它们在提供方案以帮助确定可能影响患者护理的误差来源和/或评价方法的适用性方面是相似的。它们在以下方面存在区别：

1）EP14主要关注处理过的样本和患者样本件的差别，而EP7集中注意于特定的物质或条件如一种干扰物质的存在或粘性的改变，怎样改变了患者样本的结果。

2）为了评价干扰的影响，EP14将处理过的样本与患者样本比较，而EP7在干扰增加量的存在中，用基于方法精密度和分析物的内部个体差异的标准。

3）用于确定影响是否存在的标准，在EP14中取决于来自患者样本的结果在最适线周围的分布，而EP7用一系列包含已知的不同量的被研究物质（或条件变化）的相关混合物的重复性测定的不确定性。

4）EP14将处理过的样本的相对偏差与患者样本比较，而EP7的目的是定量观察到的偏差，作为在特定分析物浓度的干扰物质（或其他特性）的浓度函数。

本指导文件打算供给诊断测试制造商，外部质量控制和内部测试提供者及管理机构。尽管由于计算的复杂性，临床实验室的使用可能被限制，观察资料和结论应当对所有的专业人员有用。本指导文件提供了评价处理过的用作标准品，定标液，控制品，EQAS和PT材料的样本的基质效应的方案。

EP14将在临床实验室，管理者，诊断设备制造商和公众的教育中，对实验室性能质量的评估对基质效应的影响有所帮助。例如，当实际上结果可接受时，读者被警告处理过的材料和分析系统相互作用引起的基质效应可能暗示产生了错误的结果。相反的，可接受的控制结果也可能给出错误的分析系统在恰当的运行中的可信的感觉。本文件中定义了用于报告这些和相关问题的术语和概念。

实验室人员可利用本文件在不同的学科对多种分析物进行定量测试。本测试方案打算适用于参考方法不存在的情形。

本方案帮助实验室人员区分系统故障的影响和使用处理过的样本的影响。但是，本方案没有描述建立基质效应的精确的机制的方法。

通过遵照本方案，制造商和EQAS及PT的供应者应当向管理或审批部门提供一些关于基质效应的文件，来帮助避免关于患者测试尚可的错误结论。

在收集或处理任何种类体液时，应当遵照标准预防。请参考最新版的NCCLS文件M29－使实验室工作者不受血液，体液和组织传递的仪器生物危害和疾病感染的保护。来自任何患者的样本都可能感染病毒如HIV和HBV。应当使用收集血液和其他体液的适当的技术，最小化对其他病人，实验室人员和其他医院或临床工作人员的危害。在处理测试样本时必须带手套。

基质效应的证明需要使用控制品，定标液（标准品），和用于外部质量评价方案的材料，以及患者样本，因为必须比较从这些材料中获得的结果。大多数控制和定标材料已经经过处理，使HIV和HBV变性，但在操作时还是应当象患者样本一样进行预防。为了进行稀释，这些物质可能必须进行广泛的吸量。这些样本决不能用嘴吸量。酸式吸量管适用于任何任务。吸耳球和合适的抽气设备必须一直与吸量管一起使用。

控制品，定标材料或稀释液可能含有有毒的叠氮化物。如果与铜和铅接触，叠氮化物也可构成爆炸物的成分。含有叠氮化物的产品在用完扔掉前，应当用大量的水冲洗。

用于微生物分析的材料应当严格按照用于预防可疑生物体的传播的可接受技术进行处理。需要时可用隔离帽和消毒技术。应当小心避免形成气雾。由于细菌和病毒化验的控制品和标准品可能含有活的生物体，这些应当适当处理。

基质效应的评价基于这样的原理，即观察到的反应与真实的活性或浓度间的关系取决于测试时的环境条件（如温度或基质）。因为没有测定技术是完全科学的，观察到的任意两种方法间的关系，取决于比较选择的样本。对临床实验室分析，设计方法是用来测定患者样本的浓度或活性，并且一组典型样本被用作比较的标准。

基质效应的大小，用来自两种被比较方法的典型的患者样本的结果的分布的比较来评估。就干扰物质存在而言，样本越不同，可料想到数据越分散。

在处理过的样本中测量到的偏差的大小，与患者样本的综合分散度比较。表示被评价方法测试的不确定性的这个残留的分散度应归因于两个因素：不精密度和非特异性。（本方案所用的回归技术使用如下假设，X轴表示的比较方法没有误差。）通过重复性测试减小不精密度的贡献，因此，在这些分析中，对分散度的主要贡献是因为那些已知或未知物质的固有干扰（这里称为基质效应）。分散的范围用预期间隔来表达，它评价了被评估方法对所有将被测试的患者样本的非特异性。然后可以断言，对于被测试的分析物用处理的样本表示患者样本是否具有合理的可能性；如果处理的样本的结果超出预期的间隔，则基质效应存在。

另外，如果一系列处理过的样本是相关的（这是在EQAS或PT中的常见情况），例如，由普通收集物混合而准备，回归这些样本的结果和比较最适直线与预期间隔可被用作评价的均值。如果对所有相关的处理样本，基质效应偏差在预期的间隔内，但不是恒定的或显示一种关系，这个技术特别有用。

来自本研究的任何结论都受处理过的样本的特定差异的限制，如生产批号，添加到样本中的分析物的来源，可能存在的稳定剂的来源等等。随后的研究可能需要确定观察到的偏差的来源。

本方案需要下列材料：

1）被评价方法的试剂，定标液和仪器系统。

2）比较方法的试剂，定标液和仪器系统。使用处理过的定标液或控制样本时预期显示小的或没有基质效应的方法。按优先顺序排序，比较方法应当符合下列描述，例如：

a） 国际参考系统（NRSCL）定义的方法（例如，胆固醇同位素稀释质谱分析法）；

b）NRSCL参考方法（例如，胆固醇Abell-Kendall方法）；

c）NRSCL认可设计的比较方法。

d）特定分析物普通使用的方法。

注意：尽管理想的比较方法应当没有基质效应，但这并不是绝对要求。从实践的原因来说，一个经常使用的临床方法可被选为比较方法。但是，当觉察到基质效应时，从方案中获得的信息仅说明患者样本和处理过的控制液在用两种方法测定一种特定分析物时没有产生可比较的结果。本方案不确定被评价方法还是比较方法具有更好的特异性。

a）处理过的样本，例如，定标液，被研究的控制样本。

b）浓度或活性大约均匀分布在感兴趣的处理过的样本的浓度范围的20个新鲜的患者样本。选择典型的用于分析的患者样本（例如，健康和患者样本），并且避免那些由于存在已知的干扰而被认为不适于分析的样本。如果冷冻不影响两种中任意一种方法的测定，也可包括冷冻样本。

1) 按照指导准备处理过的样本。

2) 用被评估的方法在一个单独的分析批内分析20个新鲜的患者样本，将处理过的样本随机的分布在新鲜的患者样本中间。将这一过程重复2遍（在单独一天内的有序的批，能更好的减小能混淆数据的可能的转变和漂移），最好分别定标。这样对20个患者样本中的每一个和处理过的样本产生3个结果（见附录B）。与NCCLS文件EP9－用患者样本进行方法比较和偏差评价一样，进行离群点检查。

3) 用比较方法分析20个新鲜的患者样本，将相同的处理过的样本随机的分布在患者样本中间（做为一个单独的分析批）。在用评价方法分析的同时，分析这些新鲜的样本和处理过的样本。重复两次这一过程，最好分别定标。按EP9的推荐进行离群点的检查。如果无法进行同时分析，应当有信息证明比较方法的结果没有因为用于新鲜患者样本和处理过的样本的储存条件而改变。

4) 将20个患者样本和处理过的样本冷冻以便进一步的分析（最好－70℃）。如果在分析中或分析后出现任何问题，可用其他的比较方法分析这些样本（例如，NRSCL定义的或参考方法）。记住，冷冻可能因为改变粘蛋白，酶的结构等引入基质效应。

在统计分析中经常出现，用户被要求判断每组数据统计测试的效用和适当性。在这些分析中，线性，异方差性和每种方法的不精密度可能影响结果的说明。不正确的假设的使用，将导致确定基质效应是否存在更加困难；来自患者样本组的预期间隔将会更宽。我们提醒用户牢记每个研究的预期目的。可参考标准统计的教科书。

1）将20个新鲜患者样本和处理过的样本（用不同的标识符）用被评价方法进行重复性测试的均值为y轴，用比较方法的均值为x轴画图。

2）检查来自新鲜患者样本的用评价和比较方法测得的结果均值的分布，证实下列先决条件：

[b]线性回归分析：[/b]

被评价方法和比较方法间线性关系的外观由患者样本产生，没有任何显而易见的弯曲。

在回归线附近y轴方向的分散度，在横跨测试的浓度范围内显示为恒量。

检查用于回归分析的数据的适用性（参考最新版的NCCLS文件EP9－用患者样本进行方法比较和偏差估计）。

然后，用被评价方法结果的均值（来自患者样本）作为y值，用比较方法结果的均值（来自患者样本）作为x值，进行线性回归分析（见附录C，例1）。

[b]多项式回归分析：[/b]

如果在比较被评价方法对新鲜患者样本结果和比较方法结果时，获得的结果分散图显示有弯曲，以被评价方法结果的均值作为y轴，比较方法结果的均值作为x值，进行第二步的多项式回归分析（见附录C，例2）：


如果在第二步的多项式回归模型中的参数 与0有统计学上的差异，（例如通过t检查确定p<0.05），用第二步的回归模型。如果 与0没有统计学上的差异（如p>0.05），用线性回归模型。

注意：为了觉察一种基于20个患者样本的取决于体内浓度分布的方法的非线性应当谨慎。可建议增加试验的样本数。如果用线性回归分析非线性相关的方法，确定基质效应是否存在将更困难。这是因为如果线性回归用于非线性关系，患者样本的预期间隔将变宽。然而，由于线性回归分析通常方便的多，并且如果基质效应大，从线性回归开始可以满足用户的需要。
注意：如果在两种方法的关系实际上为曲线时用线性回归模型，计算的预期间隔将会变宽。因此，确定处理过的样本和患者样本间真正的差异（基质效应）将更困难。

1） 如果患者样本结果在回归线附近的分散度似乎按分析物浓度成比例增加，而不是在横跨浓度范围内为常量（例如，差异除浓度为常量，而差异本身在横跨分析物浓度不为常量），对被评价方法和比较方法结果的均值进行以10为底的对数变换或者在对数坐标纸上绘图。通过步骤1，2，上面的3，接下来绘图和进行将均值进行了常用对数转换后的线性或第二步的多项式回归分析，取代均值本身。为了有效的评价在回归线附近分散度的大小，分散度的差异，或差异的变换，必须为常量。

2） 用下面给出的公式，计算最小二次方线性回归线，第二步的多项式回归线，或常用对数转换（对y变量）的回归线，在给定x值的新鲜患者样本y值的均值的双尾95％预期间隔。

这里：

=基于被评估回归线的在Xi的预期y值；
n =新鲜患者样本的数目（不是重复性测试的总数）；
=回归的标准差＝ ；
=x轴的第i个值（比较方法均值）；
=y轴的第i个值（被评价方法均值）；
=参考方法均值的总均值。
比较每一个处理过的样本y与用等式从所有患者样本数据得到的统计上定义的限（95%预期间隔）。提醒用户，如果使用方法的特异性存在大的差异，相关性将会不足，进行这一步骤没什么作用。见附录的例子。

3） 比较处理过的样本偏离回归线（新鲜患者样本）的大小与在附录C中说明的图的预期间隔。如果处理过的样本的结果位于预期间隔之外，基质效应存在（附录C，例1）。如果处理过的样本的结果位于预期间隔内，基质效应可能不存在（附录C，例2）。如果在一批或一组处理过的样本中观察到持续稳定的偏差，并且部分或全部的偏差在预期间隔内，不能排除基质效应。如果已知这些样本是相关的，例如由相同的主要收集物混合，用6.4（2）描述的步骤在评价中提供帮助。在任意浓度参差的允许或可接受限，可按独立的标准进行评价。
注意：应当注意，在CLIA规则中公布的PT限是对控制品的单独的测试，而本草案推荐使用3次重复性测定的均值。因此，为了PT目的进行的单独的测定，不是等效的实验设计，因此不推荐评价是否存在基质效应。
注意：如果被评价的样本为控制品，具有统计上重要性的基质效应，可能不具有临床或数量上的重要性。但是，如果处理过的样本被用作定标液，则相似大小的基质效应应当引起关注。

4） 相关的处理过的样本组。如果一组处理过的样本是相关的，并且它产生的结果证实有持久稳定的偏差，即使结果在预期间隔内，继续分析也可能是有用的。如果处理过的样本不知道相关性（在EQAS或PT调查中；按相同配方制造，但是不同批号），则比较相对最适直线的偏离，总的或单独的，最适直线已经从处理过的样本和新鲜患者样本结果中计算并画出。如果它们的来源相似，增加处理过的样本的数量，可能使评价受益。

对被提议的基质效应方案进行以下变化，可能提高它的可用性：

1）如果作为最后结果的数据和图不能提供足够的评价信息，分析20个以上的新鲜患者样本。
注意：20个以上新鲜患者样本的分析，将为确定基质效应是否存在提供更高的灵敏度。但是，更多样本的益处仅在于，当数量的增加时，随着n的平方根变大而增加。

2）如果在回归线附近的分布既不显示与浓度成比例，也不恒定（也就是，差异除浓度和差异本身在横跨分析物范围内均不是恒量），将这些数据分成更小浓度间隔的几组，并在每个间隔内进行线性回归分析。例如，可以分析来自新鲜患者样本结果的分散度在回归线附近显示大约为恒量的浓度范围。在每一段内使用最少10个新鲜的包含处理过的样本浓度的患者样本。

李川这次在西安的报告很好啊，值得参考：

      来自中国科学院上海药物所的李川研究员，做了题为《液相色谱流动相中电解质对ESI质谱检测影响的研究》的报告。

首先，李研究员介绍了药代动力学研究及其对基于液质联用技术的生物样品分析工作的要求。生物样品药代动力学的研究需求决定分析方法应有的特点为：灵敏度、抗干扰、浓度范围大、运行稳定。

随后介绍了液质联用分析技术中的电喷雾离子化（ESI）源中所考虑的灵敏检测与基质效应，李研究员考虑了影响ESI源效率的过程，提出了几种方式来提高ESI质谱的分析灵敏度，

1）比如提高ESI源的工作效率（选择适宜的离子化方式，让被测物更有效转化为可测的气态离子）；

2）采用高分辨或MS/MS技术等。

3）另外，在药物分析中要考虑ESI源易受基质效应的影响，美国FDA也提出要考察基质效应。

　　基质效应（Matrix effects，ME）是指在色谱分离中与被测物共流出的样品残留基质成分对被测物电离过程的影响。通常出现抑制或增强被测物的检测响应，进而影响分析的精密度和准确性。

又分为“绝对”基质效应（表示基质效应影响分析的程度），和“相对”基质效应（表示样品间基质效应大小的差异）。

[b]样品中的下列物质会产生基质效应：[/b]

[color=Red]亲水性基质成分
尿样中的盐
胆汁样品中盐
生物样品的人为添加剂（如：抗坏血酸）
磷脂类物质
药物生成的代谢物
一同使用的其它药物
制剂加工中使用的辅料物质
不同厂家生产的分析用试管所带的外源性物质
色谱柱样品过载等。[/color]

关于评价基质效应的方法，大家可以看一些文献，如：

Post-column infusion method （RCM. 1999； 13:1175）直观地显示了受基质效应影响的被测物色谱保留时间范围和影响程度；

Post-extraction spiking method( Anal. Chem. 2003； 75:3019)既能提供绝对基质效应数据也提供相对基质效应数据。

[[i] 本帖最后由 release 于 2011-8-10 10:41 编辑 [/i]]

　　李研究员所在课题组首次提出了[color=Red][b]低浓度电解质效[/b][/color]应（LC-electrolyte effects，JACS, 2007）。

最初实验观察到，低浓度电解质效应显著提高了一同检测血中六种甘草黄酮类成分方法的效能。



在提高检测响应方面更多的总结表明，低浓度电解质效应对ESI+/ESI-下都能提高被测物的检测响应，但对APCI源不起作用；

同时低浓度电解质效应不仅受流动相中电解质浓度和种类的影响，而且也受流动相中有机溶剂比例的影响；

在相同条件下，不同被测物的表现也不同；

不仅提高检测响应，还能提高分析方法的检测下限（LLOQ）。

　　另外，低浓度电解质效应具有抗基质效应的作用，是通过缩小其干扰视窗，有助于建立快速的药代生物样品分析方法。抗基质效应作用的大小受流动相中电解质的浓度高低影响，浓度低则抗基质效应作用强。这种低浓度电解质的抗基质效应的作用，可在大批量样品分析中持续，可用于“大进样量”分析，还可提高某些分析物的定量上限（ULOQ）。

综上所述，低浓度电解质效应提高了ESI的效率和容量。

[color=Blue]他的意思是说，样品里先加入一些合适的、低浓度的电解质，浓度从低到高，开始时，这个电解质是有利于降低基质效应的，可以提高样品的信号响应，并且向上、向下扩展标准曲线。
继续提高电解质浓度后，就不行了。[/color]