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标题:[求助]单个核细胞分离出现的污染问题

gogo[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]单个核细胞分离出现的污染问题



应用密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞，分离过程按照操作规程实施，分离完成培养一天后，发现培养液显混浊，有流沙状细小物质，倒置显微镜下400倍观察，发现小黑点样物质，有蠕动现象，如图所示

所有实验用品均更换后依然出现同样情况，单独培养实验试剂均无污染，取污染的培养液革兰氏染色未见细菌检出。

第二次实验结束时，未培养直接镜检，镜下可见小黑点样物质。

请各位高人帮忙分析下，小黑点物质到底为何，如何解决？


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2012-4-26 17:40
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发表于 2012-4-26 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否是破碎的细胞碎片?
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KGZ564[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能是细胞碎片，貌似部分像血小板~~~~~
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wsll[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主放心，这个是红细胞。正常的！
可用红细胞裂解液除之，或者改正一下你的分离液，估计这个的密度不对。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主不要心急，按照正常的操作进行下去，只要检测没有问题，就行，黑点有点像血小板，是不是分离条件把握的不好。
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发表于 2012-4-26 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
遇到问题很常见，楼主不要灰心。我分的一批单个核细胞，加入RANKL和GM-csf诱导后培养，前4天还好，第5天发现突然全部裂解了（见图），不知道什么原因？搭车问一下高人。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主放心，这个是红细胞。正常的！
可用红细胞裂解液除之，或者改正一下你的分离液，估计这个的密度不对。

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应该不是分离液密度的问题，分离液用的是密度1.077的人淋巴细胞分离液。
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tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该不是分离液密度的问题，分离液用的是密度1.077的人淋巴细胞分离液。

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但是你考虑了样品的稀释的问题了没有啊
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cocacola[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主放心，我可以保证你分离的细胞没有被污染，当中的黑点是血小板，血小板的密度比单个核细胞小，你可以这样去除其中的黑点：
收集了中间层（淋巴细胞层）细胞之后不要立即接种，用PBS或者培养基反复离心1000rpm，5min清洗，我第一次分离的时候情况和你一样，第二次我就多次清洗，背景非常干净了，一般冲洗10次之后就不会再有黑点了，实验顺利
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gogo[使用道具]
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发表于 2012-4-26 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，应该是细胞碎片和血小板，问题已基本解决！
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