小中大
谢谢楼主,我昨天第一次养心肌细胞,但今天看状态很不好,贴壁松,不舒展,未见伪足,更加没有搏动,我把步骤大概写一下,希望楼主指点一二:
一共用了6只乳鼠,整个过程中,除了洗心脏和剪心脏用PBS+glucose外,中和用的培养基是含钙镁的,配胰酶用的溶液是PBS+glucose,即不含钙镁的:
1. 75%消毒小鼠,消毒后小鼠是活的;
2.开胸,迅速取出心脏,置PBS+glucose溶液;同样的方法处理其余5只乳鼠;
3.修剪6只乳鼠心脏,之后剪碎(剪不成1 mm的,大约1-3 mm不等吧;我是全部心脏取出来之后,统一修剪再统一剪碎,这样会不会不好?);
4.胰酶(Gibico,买来就是配好的,0.25%,含EDTA,稀释成0.8%,用PBS+glucose稀释,胰酶事先已温育)消化,6只乳鼠同在一支50 ml离心管,放7 ml胰酶,37度水浴,10 min,边浴边轻摇(整个过程都在轻摇,基本没怎么间断,是不是不好?);
5.取上清(没有静置)置于另一支50 ml离心管,该管置于冰中,预先放置预冷的20% FBS+M199(含钙镁);
6.继续加入7 ml胰酶,37度水浴消化,消了6次,分别是10 min,10 min,6 min,10 min,6 min,6 min,取上清和中方法同上;最后三次消化可见胶冻状物质,我用枪头较用力吹打,可打散;
7.3支离心管离心收集细胞(未过滤),以68 g,5 min离,见不到沉淀,换用200 g 5 min,沉淀还是不明显,将看到的沉淀吹散后以300 g 10 min离心,可看到少许沉淀;
8.每支离心管以2 ml培养基重悬,种6孔板中的3个孔(1支管的东西种一个孔),镜下观察只有第3支管(即最后两次消化得到的上清)细胞才多,前两个支管收集的细胞加起来都没有第三支管一半多,而且有支管的细胞不透亮,稍有皱缩(今天看这个也的细胞基本死光);
9.差速1 h。