细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】正在养或已经养过HUVEC的请进

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 151  2/16 ‹‹12345678910›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】正在养或已经养过HUVEC的请进

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
11

发表于 2015-7-9 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jude 于 2015-7-9 10:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

因为没有用过ECGS进行培养，所以不太清楚使用量，可以请青衫兄来解答一下。今天晚上给HUVEC传代，进行种植。不顺。在加胰酶前用培养基冲洗以后，发现细胞突然变圆。可能与培养基，以及细胞的量（今天70～80％）不足，还有冲洗力度有关。 ...

我也没有用过ECGS，都是用的是ECGF，不过两个的主要成分差不多的。呵呵！就是纯度的问题了。帮常子兄弟查了查文献，看样子都是用的50ng/L（也就是50ug/ml），也有用高一些的，100ug/ml的，文献都附在下面。 Tongue
另外，你做实验的可以看情况，要是细胞长得不好就多加点生长因子吧。不过，最好是用好点的胎牛血清。
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
12

发表于 2015-7-9 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是SIGMA公司的ECGS，HYCLONE的特级胎牛血清，1640培养基，每三天换液一次，细胞培养了一个月仍不足80%，25cm2的瓶子，烦极了，老板要我快点做试验，但细胞数不够。什么方法可使细胞生长快些？
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
13

发表于 2015-7-9 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我复苏HUVEC不离心，加入约8倍的培养基在瓶子中，然后再把已解冻的细胞液加进去，让其贴壁过夜，次日换走含DMSO的培养液就可。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
14

发表于 2015-7-9 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 greenbee 于 2015-7-9 11:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的是SIGMA公司的ECGS，HYCLONE的特级胎牛血清，1640培养基，每三天换液一次，细胞培养了一个月仍不足80%，25cm2的瓶子，烦极了，老板要我快点做试验，但细胞数不够。什么方法可使细胞生长快些？ ...


在没加ECGF和肝素的前提下，使用同样的奥地利标准血清，我的感觉是DMEM/F 12比1640的效果要好一些，你可以试试。F12较适合原代培养。对了，如果用的是细胞株，最好用与原先一样的培养基。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
15

发表于 2015-7-9 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问下，复苏HUVEC离心时，离心的速度与时间怎样的？实验室的老师建议我1000rpm 15~20分钟，文献上报道大多在5分钟左右。
可我上次复苏离心5分钟，细胞好像没下来都丢了。

==============================================================================================================

一般的离心力都是用g的多少倍来计算的，它与离心机的臂长和转速有关。而离心效果的好坏除了与培养的细胞种类有关外，与离心力有很大的关系。因为实际上使用的离心机，其硬件有差别，因此，参考别人的指点的同时，最好自己摸索一下，到底什么样的转数和时间适合你用的离心机和你要离心的细胞。一点个人经验，呵呵，献丑。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
16

发表于 2015-7-9 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的那个离心机可以考虑退休了。转速早就不准了，我现在都是离心后肉眼观察，摸索转速。
另外，关于原代培养时的离心问题。今天又做了一次原代培养，再一次感觉到原代培养步骤复杂，费时。突然考虑到能不能收集到细胞后，不离心。
直接加培养基＋血清后，放在一个大的 培养瓶里进行原代培养，这样可以减少离心对细胞的损害，以及减少离心过程中的污染机会。
但是这需要有个前提，就是收集后的细胞悬液（已加培养基和血清）的体积小于培养瓶的容积。
因为离心的主要作用就是为了收集细胞以得到最大量，好像没有别的作用，但却会增加细胞损伤。
如果离心单纯为了除去过多的液体，那么何不留着这些液体（主要胰酶，可以用足够量的血清中和）不离心，以减少对细胞的损伤。
不知道有人这样做过没有，过几天试试。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
17

发表于 2015-7-9 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再这里问问，你认为血清中和胰酶的比例是多少？
如0.1％胰酶：胎牛血清？或者小牛血清？
顶部
dior[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72222
精华 1
积分 582
帖子 819
信誉分 102
可用分 4906
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
18

发表于 2015-7-9 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不知你用的血清浓度是多少,我用的是20%,另外细胞分布不均也会影响其生长,如果有此情况,建议你消化重新让细胞贴壁,分布均匀后生长状态也会好的多.还可考虑增加ECGS的浓度.
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
19

发表于 2015-7-9 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2015-7-9 11:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的那个离心机可以考虑退休了。转速早就不准了，我现在都是离心后肉眼观察，摸索转速。
另外，关于原代培养时的离心问题。今天又做了一次原代培养，再一次感觉到原代培养步骤复杂，费时。突然考虑到能不能收集到细胞后，不离 ...

这样很不好，细胞培养液太多，细胞生长的微环境受到的影响就比较大。培养瓶太大，细胞的社会性受到影响，肯定得很长时间才能长满，必然的结果是细胞老化死亡。离心的目的，还可以洗除一些杂质，尽量去除胶原酶。另外，其实，离心一次对细胞的损伤并不大。你可以再买一个离心机啊，才不到一块（普通的小的）。如果你用那么多的培养液岂不是浪费吗？如果不加各种营养成分，那么细胞贴壁也会受到影响的。当细胞离体后，如果不给足够的生长因子刺激，它可能不贴壁，或者在悬浮的同时走向寻短见的道路。因小失大，不太可取。你可以试试，结果必定不好。 Tongue
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
20

发表于 2015-7-9 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2015-7-9 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

再这里问问，你认为血清中和胰酶的比例是多少？
如0.1％胰酶：胎牛血清？或者小牛血清？

据说，只要带点血清就可以中和掉胰酶，我做过蚓激酶的实验，1%的血清浓度就足够中和很大浓度蚓激酶。虽说两种酶不太一样，但是从我消化的经验可以知道，5%的血清1ml(是血清就可以，不论胎牛还是小牛)就足足够中和0.25%的胰酶1ml了，甚至更少，更低浓度。所以，消化的时候，务必将含血清的培养液尽量洗除干净。
顶部
 151  2/16 ‹‹12345678910›››|