PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】MSP电泳图结果 求解

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 29  2/3 ‹‹123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】MSP电泳图结果 求解

wanglaoshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77295
精华 0
积分 449
帖子 597
信誉分 100
可用分 3796
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
11

发表于 2015-8-1 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
555...抓狂~
怎么就被污染了呢，看来是要重来一次了。。。
顶部
whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态 离线
12

发表于 2015-8-1 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这里有个问题，近期我也做MSP，但每个非甲基化引物那管都能跑出条带，而且条带的大小和亮度均基本一致，条带的大小跟扩增的目的片段也是一致的，所以不知道这个是不是属于正常现象。我看楼主的上图U带也基本都有，而且亮度也基本一致。
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
13

发表于 2015-8-1 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 whitesheep 于 2015-8-1 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我这里有个问题，近期我也做MSP，但每个非甲基化引物那管都能跑出条带，而且条带的大小和亮度均基本一致，条带的大小跟扩增的目的片段也是一致的，所以不知道这个是不是属于正常现象。我看楼主的上图U带也基本都有，而且亮度也基 ...

可能是你的样本中存在一定量的正常细胞或组织，所以U带恒定出现。当然，癌组织中的抑癌基因启动子区也不是百分百甲基化的，亦可能有某些肿瘤细胞为非甲基化。
顶部
toy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77357
精华 0
积分 716
帖子 1052
信誉分 100
可用分 6165
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
14

发表于 2015-8-1 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢楼上的解答。我本来对这样的条带也是半信半疑，因为我觉得无论是任何标本为什么这些条带都这么一致，而且我跟楼主情况一样，空白组也居然跑出类似的条带，后来换了下热启动酶缓冲液MIX，空白组就跑不出这样的条带了。自我感觉也没有污染。参考文献提供的退火温度是62度，而我目前所做的退火温度为54度（引物根据参考文献设计），我们做的是人体不同部位的标本。请问楼上专家，相差这么大的温度，正常么。谢谢！
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
15

发表于 2015-8-1 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 toy 于 2015-8-1 16:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢楼上的解答。我本来对这样的条带也是半信半疑，因为我觉得无论是任何标本为什么这些条带都这么一致，而且我跟楼主情况一样，空白组也居然跑出类似的条带，后来换了下热启动酶缓冲液MIX，空白组就跑不出这样的条带了。 ...

可以试试再把退火温度提高一点。
为避免MSP的假阳性，PCR的退火温度不能太低，循环次数不能太多。
MSP确实是检测甲基化的一个快速灵敏的手段，但是由于它存在无法避免的假阳性可能，所以近年来逐渐被审稿人诟病，要想自己的文章档次高一点，经费也允许，还是做BSP吧，或者选用其他高通量的方法。
顶部
hyuu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79232
精华 1
积分 626
帖子 847
信誉分 102
可用分 5149
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
16

发表于 2015-8-1 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，再请教个问题：DNA修饰时如果因为DNA过量而出现假阳性，是否可以通过参照普通引物所扩增出来的条带，与原先的条带比较亮度值，而确定是否存在假阳性。谢谢！
顶部
ns5fan[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114518
精华 1
积分 416
帖子 510
信誉分 101
可用分 3353
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
17

发表于 2015-8-1 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

甲基化中糖原的作用大吗？如果不加糖原的话，－20摄氏度沉淀过夜会产生沉淀吗？每次做到这一步时，就害怕吸取残余乙醇时会把修饰纯化好的DNA吸走，请问你们是这么做这一步的呢？至今我还没有P出自己的目的条带，急啊，还有，我用的是普通的TAq酶，有影响吗？
顶部
33号[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74277
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4611
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
18

发表于 2015-8-1 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ns5fan 于 2015-8-1 16:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

甲基化中糖原的作用大吗？如果不加糖原的话，－20摄氏度沉淀过夜会产生沉淀吗？每次做到这一步时，就害怕吸取残余乙醇时会把修饰纯化好的DNA吸走，请问你们是这么做这一步的呢？至今我还没有P出自己的目的条带，急啊，还有，我用的是普 ...

我用的试剂盒跟你的不一样，所以你说的这个我就不知道了。没有P出目的条带原因很多，引物是很重要的，建议最好换成热启动酶，这样分析原因也少了个因素。
顶部
dior[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72222
精华 1
积分 582
帖子 819
信誉分 102
可用分 4906
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
19

发表于 2015-8-1 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
噢，我是手工修饰，用PROMAGA的纯化试剂盒，纯化完成后加无水乙醇过夜沉淀时从来没有看见过沉淀，加70％乙醇洗涤时就很谨慎了，一不小心DNA就没了，各位做到这一步时有什么好方法介绍一下吗？还有，什么样的热启动酶又好用又便宜呢？谢谢
顶部
wanglaoshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77295
精华 0
积分 449
帖子 597
信誉分 100
可用分 3796
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
20

发表于 2015-8-1 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
近期重复了两三次，期间也换了相应的hotstart酶，引物，水，PCR管等等，结果出来的空白水对照还是依然存在目的条带，已经心力憔悴了。。。
另外想问下大家，用过5-Azacytidine这一DNA甲基转移酶抑制剂么？都用什么溶剂溶呢？我查的文献有提到用醋酸溶，PBS。但是看到cuturl('http://www.majorbio.cn/NewsInfo.asp?id=237')上关于5-Azacytidine的介绍上提到 Aza-C为白色针状结晶，溶于水，在酸和碱中易水解。所以文献跟这个是不是存在冲突呢？还是说虽然有易水解这一缺点，但是其有在酸碱中更易溶这一优点？所以就视缺点不见，从优了？
顶部
 29  2/3 ‹‹123››