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标题:【转帖】肝星状细胞实验步骤

dodoit[使用道具]
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这个不难,多练习几次就好了。
插管可以用线绑住固定,或者用止血夹夹住。
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lyxsqs[使用道具]
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楼主,你在动物房做不怕被污染的吗?
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箭头儿[使用道具]
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1。相对来说,我们动物房的中央空调很好的运转,通风比较好,没有那么脏。
2。我是灌流结束后的水浴锅开始是在另一个实验室。
3。我个人觉得,污染发生在开始培养后的操作不当,或者比如恒温箱等原因。因为第一步在体灌流不可能做到无菌,肯定会暴露到空气中。所以这一步会有一定的空气中的细菌进入你的系统当中。但是从灌流结束开始,进行了严格的无菌操作,所以一开始的那部分细菌会在各个操作过程中,越来越稀释。比如,一开始你在体灌流的时候有10个细菌贴附到你的肝脏,那么经过中间很多步操作,到最后你把细胞加入到培养基的时候,可能就只剩下1个或2个。然后还得看这个细菌是否适合在你的培养基条件下生存,能否抵抗你的培养基中的双抗的攻击,等等。所以,一开始所进入的污染相对来说影响没有那么大。
个人体会,请指教,谢谢。
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baidukk[使用道具]
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好贴!强烈同意TK兄的说法,开始无菌确实很难,不过也无妨。
也贴一张图,支持一下做HSC的同胞


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2015-8-10 16:54
82878885.snap.jpg (77.87 KB)
 
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龙小好汉[使用道具]
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谢谢两位分享经验。liangyuejin,黑色的小鼠是C57吧?
楼上,是否可以贴一张刚刚接种下去的细胞的图片呢?
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龙小好汉[使用道具]
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在细胞得率上,我有一点体会:就是在密度梯度离心之前,尽可能的得到单细胞悬液.
DnaseI的作用很关键,可以将细胞团块分散。
我的经验是,有一次取分层细胞的时候,不小心将枪头调入离心管中。分层被底部沉淀打乱,取出枪头后重新梯度离心,分层消失。
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baidukk[使用道具]
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说的很对,单细胞悬液很重要的,我也有同感
黑的小鼠是C57 的,以前拿来做门静脉穿刺练习的,刚开始操作失败很多次哦
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龙小好汉[使用道具]
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现在楼上的SOP成了大家的主要参考,但是我有两个疑问:
1)消化液是链霉蛋白酶E加DNaseI。为什么不加一点胶原酶?如果加的话,浓度多少合适?
2)在消化后,有加入含血清的培养基终止。胶原酶的消化真是可以被终止吗?
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箭头儿[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 龙小好汉 于 2015-8-10 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

现在楼上的SOP成了大家的主要参考,但是我有两个疑问:
1)消化液是链霉蛋白酶E加DNaseI。为什么不加一点胶原酶?如果加的话,浓度多少合适?
2)在消化后,有加入含血清的培养基终止。胶原酶的消化真是可以被终止吗? ...

1. 我的方法上,消化液从来都是有胶原酶的阿。呵呵,兄弟再看看我的protocl吧。
2. 血清本身不是抑制胶原酶的活性,而是通过降温和稀释来中止消化。所以我平时终止消化的是放在4度的含有血清的DMEM。
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baidukk[使用道具]
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果然如此,消化液是用solutionII配制的。
请问选择I型有其他的文献支持吗?因为我看在大鼠用的几乎都是IV型。
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