【求助】我提的RNA能做RT吗？ - 经验共享

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】我提的RNA能做RT吗？

27 2/3 ‹‹1 2 3 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】我提的RNA能做RT吗？

greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态离线

发表于 2015-8-31 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做rt的rna有如下要求:
18S和28S要清晰,且后者比前者亮.我感觉你的rna 不是很好,建议重提

莲花白[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74499
精华 1
积分 286
帖子 247
信誉分 102
可用分 2016
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态离线

发表于 2015-8-31 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以做，但你1、3孔好像有大分子物，象DNA。
我觉得你的RNA跑的挺好的。
试试吧。

baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2015-8-31 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不错，你的实验结果挺好，可以继续。：）
我提了RNA，鉴定也走电泳，1%普通胶，60-70V，10分钟左右观察。降解不明显。

zhezhe[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 72891
精华 1
积分 610
帖子 856
信誉分 102
可用分 5088
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2015-8-31 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我建议不要做电泳的，因为你如果做得是rt-pcr，只需要用紫外分光度计测出rna的质量就可以了，这样决定了是否需要重新提取。。。。。。

remonte[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114516
精华 1
积分 356
帖子 387
信誉分 102
可用分 2698
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2015-8-31 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我认为降解的问题还在其次，在加样孔有DNA带，好像有DNA污染，如果你接下来做RT-PCR的话，就有问题了，到底是RT后的cDNA的扩增，还是基因组DNA的扩增呢？所以有必要加DNA酶处理，消除DNA。

october7[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77254
精华 0
积分 448
帖子 616
信誉分 100
可用分 3856
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

发表于 2015-8-31 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上很多同仁已就你的问题提出了宝贵的分析意见和建议,我看了你的RNA电泳图谱,有以下建议,供你参考:
通过你的RNA电泳图谱,可以看出你提的RNA稍有些降解,如果你的试验对RNA要求不高,扩增的基因表达丰度很高,是完全可以用的.
RNA提的好坏,基本标准:OD260/280比值1.8-2.0,2.0质量最高.电泳图谱28S和18S带清楚,比值为2:1,如28S和18S的比值越小,说明RNA的降解程度越大,如28S和18S带消失,则意味着RNA完全降解,一定要弃之勿用,避免浪费.用1%普通胶,120-150v电用即可观察RNA的完整性情况,不一定非得使用1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳.
总之,高质量的RNA(完整性和纯度)是开展与RNA相关研究的前提和基础,一定要提好RNA!

txwuyan[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114485
精华 0
积分 328
帖子 375
信誉分 100
可用分 2614
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2015-8-31 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 october7 于 2015-8-31 15:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼上很多同仁已就你的问题提出了宝贵的分析意见和建议,我看了你的RNA电泳图谱,有以下建议,供你参考:
通过你的RNA电泳图谱,可以看出你提的RNA稍有些降解,如果你的试验对RNA要求不高,扩增的基因表达丰度很高,是完全可 ...

解释的很清楚阿,我们平常提RNA之后也是跑普通胶,但是无论是普通还是变性,电泳肯定是必须的.

gogo[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77052
精华 0
积分 821
帖子 1341
信誉分 100
可用分 7487
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2015-8-31 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问您提到的0.5*TAE和1*TAE是什么意思，与跑dna 的TAE有何区别？
另外我最近做RT-PCR碰到的困难是：我早上造大鼠脑缺血模型，过12小时也就是晚上十点左右必须取材，我只能将取下的海马和皮层加入裂解液匀浆后
放到负70度冰箱，第二天早上来提RNA。紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,只有1.4-1.5,甚至会出现1.3-1.4。但浓度还行300-500ng/微升。
放在冰箱里是不是有影响，我应该注意些什么。
比值低但是浓度高，提示什么，这样的样本能做RT-PCR吗？
恳请指教！！！

===============================================================================================================

从该图看,28S和18S均清晰,RNA的质量应该是可以的对于提取的RNA一般需要鉴定质量和纯度这是必须的,虽然电泳比较烦琐
1.紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,如果在1.6-1.8,说明RNA质量可以,同时可以对RNA定量,知道提取到的RNA量,这对于进行定量分析很重要
2.此外还需要通过电泳鉴定RNA的完整性,分子克隆推荐的方法是1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳,若28S和18S清楚,比值为2:1,则表示RNA完整,降解的RNA电泳中28S和18S条带消失,且主要的片段集中在18S的前方.在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下
3.在下面的鉴定就是你的RT-PCR了,如果扩增阳性,那就不用担心拉.

dior[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 72222
精华 1
积分 582
帖子 819
信誉分 102
可用分 4906
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态离线

发表于 2015-8-31 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位有人认为RNA 18S和28S为1:2才不降解，可能是从书上看的吧，实际操很难达到，并且RNA有物种和组织特异性，有的组织和昆虫的18S和28S并非如此，可能还不是18S和28S。

cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2015-8-31 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果我是你我就不作了。大量DNA污染，有破坏和降解。除非是像看家基因一样好扩的，否则我几乎可以联想您做不出来的情况了。

各位有人认为RNA 18S和28S为1:2才不降解，可能是从书上看的吧，实际操很难达到，并且RNA有物种和组织特异性，有的组织和昆虫的18S和28S并非如此，可能还不是18S和28S。
物种差异性我不敢否定，我没有做过，但是提到1:2实在也不是什么难事。如果你比较愿意出钱用Qiagen就行了。呵呵
此外比例不对不一定是RNAase作用的结果，可能是机械破坏而导致。

27 2/3 ‹‹1 2 3 ››