小中大【求助】ployA加尾法PCR U6引物加什么?
相关疾病:
白血病
各位老师,前辈,学生生首次做microRNA,遇到一个问题,特来求助。我做的是白血病细胞株的microRNA,首先用traka 的triziol 提取了细胞的总RNA,OD260/280 是1.83,浓度大概2.5ug/ul,用ployA加尾法做逆转录(也是traka的试剂盒 D035A),加尾和逆转录的过程是在一起的,没有加任何的特异引物,试剂盒有通用的逆转录引物,逆转录完成后就用染料法做定量,待测的microRNA用特异性的正向引物,反向引物也是试剂盒配的通用引物。内参选用U6,现在的问题是我的U6的引物应该只加正向引物然后反向用通用的引物吗?
实验的过程中发现待测的miRNA曲线都有出来,我的U6加特异性正向引物和通用反向引物,曲线跑不出来,当我改成U6加正反向都是U6的引物后就可以跑出来了,但是CT值一直不高,30以后。这是为什么?
还有一个问题是U6在ployA加尾的过程中应该也会一起加尾吧,按这个道理来说,U6也加尾了,我定量的时候应该是用特异性正向引物+通用反向引物的,为什么这样就跑不出来了?而改成特异性的下游引物后就可以跑出来了。
希望各位老师、前辈帮忙解答,**。
我的U6引物是:
U6-F :5-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3
U6-R :5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3