【求助】总RNA提取不出来 - 经验共享

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标题:【求助】总RNA提取不出来

standbyme[使用道具]
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发表于 2016-2-8 21:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用液氮研磨后就可以了，目的是使组织块变小，便于后一步加trizol使核蛋白体完全分解。加入trizol后，要确保trizol中的组织不能成团，有结团的话要吹打均匀。另外，加异丙醇反应这一步，要混匀使rna与异丙醇充分反应，使其沉淀。我之前有过深刻的教训，因为没混匀，白白浪费了一个多月，最后才找到是这个原因。还有可能就是rna出来后，加入75%乙醇这一步，要注意先加750ul乙醇，后加250ulDEPC水。

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为何要先加750ul乙醇，后加250ulDEPC水？有什么讲究么？

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2016-2-8 21:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得你应该把你的详细步骤说出来让大家分析，既然你用别人的trizol和别人帮你做都没有做出来，我怀疑是不是你取材的时候没有注意，就是你在做实验之前，RNA已经降解了。如果是后面的实验步骤有些问题一般最后电泳都会看到降解的条带，不会什么都看不到。

standbyme[使用道具]
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发表于 2016-2-8 21:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得你应该把你的详细步骤说出来让大家分析，既然你用别人的trizol和别人帮你做都没有做出来，我怀疑是不是你取材的时候没有注意，就是你在做实验之前，RNA已经降解了。如果是后面的实验步骤有些问题一般最后电泳都会看到降解的条带，不会什么都看不到。
我这段时间提RNA 也是什么都没有,我的是霉菌,我想问一下,如果实验之前RNA已经降解了,电泳就什么都看不到吗?还是有降解带?谢谢

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2016-2-8 21:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般做实验的过程只有1小时，如果你用新鲜的组织在一个小时里基本不会降解为单个的核苷酸，所以跑电泳还能明显看出5s或更小的亮带。要是你用保存不好的组织，有时候你的组织放在冰箱很长时间了，所以只要有RNA酶，一般就会降解成单个核苷酸了。这样跑电泳就什么都看不到了。

hold住[使用道具]
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发表于 2016-2-8 21:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是提细胞里的RNA，每次离心配平的时间都很长，是不是这段时间里RNA就给分解了？我用的是DEPC水配的酒精，高压之后用来洗RNA，行吗？

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2016-2-8 21:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 hold住 于 2016-2-8 21:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我是提细胞里的RNA，每次离心配平的时间都很长，是不是这段时间里RNA就给分解了？我用的是DEPC水配的酒精，高压之后用来洗RNA，行吗？

自己养的细胞应该还比较好提RNA，至少在你提之前它是活的。收集细胞的时候应该不会降解，因为你的细胞还在你的培养基里面，它还是有活性的。洗RNA的只要用DEPC水配就好了（但是乙醇最好是新开的），可以不用高压灭菌。

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你是怎么知道自己没提出来的？用rt-pcr来做pcr了吗？
最后离心后能看到试管底部的白色羽状固体吗

baidukk[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

把标本给我，我帮助你提取，不可能提不出来．

baidukk[使用道具]
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