PCR仪

回答：扩增如此之大的片段，难度太大。分为小片段扩增，长度在400bp以下，我感觉比较容易。

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我也明知楼主所说的，无奈老板想出来的主意，总得做，我现在扩出来的基本都是1KB以下的，还没有扩出3KB的目标条带，估计是人基因组上的错配吧！

但是我转化实验后在做 梯度PCR 结果还是什么也没有.请你帮我分析一下,我该从哪个方面去找问题,急急!!!
再次非常感谢大家的帮助!!!

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回答:如果做测序,修饰DNA 的纯度和模板量应更为重视.如果您做MSP,在保证DNA纯度和量的基础上,可以在摸索退火温度\更换良好的热启动酶等条件未果的情况下,尝试更换引物!MSP看起来简单,做起来不易出结果,我感觉很大一部分与引物有关.

楼主，我在成功P出条带后拿去直接测序，但成功率非常低。我看文献，很多是去做克隆的，这是不是因为bsp直接测序本身就比较困难，还是因为引物的缺陷。

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用BSP产物去测序是很困难的，原因有两点：1）BSP产物本身是杂合状态，造成这个的原因又是由于CpG site可能存在不完全甲基化或者反过来说不完全去甲基化的状态，所以在Bisulfite conversion过程中这些位点可能是“C"也可能是”T"，测序仪和测序员都会被搞糊涂的，就测不下去了；2）Bisulfite conversion后大量连续的“T"或”A"出现，这是测序的大忌，也会造成测序不成功。
至于用克隆测序为什么被普遍采用也就因为有经验的前面的研究者他们知道这两个问题的严重性，克隆可以避免第一个问题。另外，克隆测序还可以较为精确定量的算某CpG site甲基化或去甲基化程度，而PCR产物直接测序只能看个大概。
个人的经验，你如果拿PCR产物直接测序，测序公司跟你说测不出来的时候，你千万不要说你是做甲基化，不然他们以后会理直气壮的拒绝帮你重试，呵呵。因为，多测几次甲基化PCR产物是有可能成功的。
嘿嘿，不厚道了，不要外传哦。