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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-19 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。
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发表于 2013-1-19 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试

============================================================================================================

另外，我的目的蛋白是膜蛋白，我是用SDS裂解液提了总蛋白来做western blot的，不知道这样是否合适？裂解的时候需要注意什么？谢谢！
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发表于 2013-1-19 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用的是碧云天的SDS裂解液，提取后测蛋白浓度在14mg/ml的样子，胶倒是没染过……怎样判断蛋白是否 提取完全？

=======================================

先通过电泳染胶
看目的分子量附近的条带怎样
另外看提取有没有完全就靠后续的实验步骤了
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发表于 2013-1-19 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，我的目的蛋白是膜蛋白，我是用SDS裂解液提了总蛋白来做western blot的，不知道这样是否合适？裂解的时候需要注意什么？谢谢！

==========================

当然可以用总蛋白来做WB
裂解的时候注意在冰上操作
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发表于 2013-1-19 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

=====================

呵呵
去年这个时候我做过VEGF
大鼠腓肠肌的
受体没做过
我用的santa 的一抗
效果我觉得还行
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发表于 2013-1-19 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先非常感谢你及时给大家这么多的帮助！我是新手，有个问题请教。我W的结果没有条带，自己将膜丽春红染色无蛋白条带，同时一起转膜的同学是有W的条带的，他的分子量是200KD，我的是110kd。前面电泳条件是100v，120V，湿转100v 2h，但电转液中没有0.1%SDS（不知是否影响，我们实验室常规是这样配的，其他成分同园子里的常规），请问是我的蛋白降解了吗？前几天看到丽春红染色都是要带的，包括110kd。请指点，万分感激！
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发表于 2013-1-19 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 sunnyB 于 2013-1-19 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先非常感谢你及时给大家这么多的帮助！我是新手，有个问题请教。我W的结果没有条带，自己将膜丽春红染色无蛋白条带，同时一起转膜的同学是有W的条带的，他的分子量是200KD，我的是110kd。前面电泳条件是100v，120V，湿转100v 2h，但 ...

大分子量蛋白转移的时候是要加0.1%的SDS的
我一般用的转移缓冲液中用0.01%SDS这样大分子量与小分子量都用同样的转移缓冲液
蛋白是否降解你要了解一下你的蛋白的背景信息
另外在提取液中要尽可能多的加入抑制剂
good luck
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发表于 2013-1-19 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
挫伤
我做的是大鼠脊髓挫伤，检测caspase-3的WB,摸一抗，二抗浓度，做了好几个月也没出结果，一抗是Santa的，技术应该是没什么问题，现在可以把 内参显得很漂亮，就是不出目的条带，强烈怀疑santa的抗体不稳定（在论坛上也听到sabta抗体不好用的声音），我们是90次，300多元钱的，建议xdjm,如果实在不出结果，应该考虑下抗体的稳定性，不要为省钱买太便宜的抗体，否则费时费力！
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 小中大
当然可以用总蛋白来做WB
裂解的时候注意在冰上操作

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谢谢指点，打算先染一下胶看看，不行再重新提蛋白。
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 小中大

相关疾病：
挫伤

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我做的是大鼠脊髓挫伤，检测caspase-3的WB,摸一抗，二抗浓度，做了好几个月也没出结果，一抗是Santa的，技术应该是没什么问题，现在可以把 内参显得很漂亮，就是不出目的条带，强烈怀疑santa的抗体不稳定（在论坛上也听到sabta抗体不好用的声音），我们是90次，300多元钱的，建议xdjm,如果实在不出结果，应该考虑下抗体的稳定性，不要为省钱买太便宜的抗体，否则费时费力！

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呵呵
抗体的好坏不是我们说了算
santa的我用了有三、四种了吧
感觉还行
你的caspase-3现在还没做出来？
我2006买过博奥森分装的
做出来过
抗体的选择是由自己来决定的
那都有不好的抗体
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