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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-19 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢！还有个菜问题：我如何判断转膜不成功、转过头了及短路了呢？感谢哈！
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发表于 2013-1-19 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我跑了磷酸化的P38的条带，不知为何出现了两个条带，其中一条较淡，就好像磷酸化ERK一样，一抗用的是Cell signaling的，稀释比例为1：1000，想请问下您这有可能是哪方面的原因啊？谢谢
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发表于 2013-1-19 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

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呵呵
做过纯化后的蛋白
从组织或细胞提取的暂时没有做过
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发表于 2013-1-19 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢！还有个菜问题：我如何判断转膜不成功、转过头了及短路了呢？感谢哈！

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转膜后染色液染膜
染转移后的胶来判断
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发表于 2013-1-19 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我跑了磷酸化的P38的条带，不知为何出现了两个条带，其中一条较淡，就好像磷酸化ERK一样，一抗用的是Cell signaling的，稀释比例为1：1000，想请问下您这有可能是哪方面的原因啊？谢谢

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看看抗体说明书
像你这样的问题我觉得是抗体本身的问题
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发表于 2013-1-19 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前辈，你好，我的课题要做CGRP　3.8kd的一个短肽的western. 我用的是16.5%的tricine的胶，但是跑出来条带和溴酚蓝本身一直很弥散。我的上样量比较多，因为用了冷冻干燥来浓缩，不知道又没有关系？我用的胶是单体丙烯酰胺30% 双体0.8%的成品，是不是交联度不够呢？多谢指点！
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发表于 2013-1-19 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前辈，你好，我的课题要做CGRP　3.8kd的一个短肽的western. 我用的是16.5%的tricine的胶，但是跑出来条带和溴酚蓝本身一直很弥散。我的上样量比较多，因为用了冷冻干燥来浓缩，不知道又没有关系？我用的胶是单体丙烯酰胺30% 双体0.8%的成品，是不是交联度不够呢？多谢指点！

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tricine胶没做过
我觉得这样的分子量用dot blot来做比较好
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-1-19 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前辈，你好，我的课题要做CGRP　3.8kd的一个短肽的western. 我用的是16.5%的tricine的胶，但是跑出来条带和溴酚蓝本身一直很弥散。我的上样量比较多，因为用了冷冻干燥来浓缩，不知道又没有关系？我用的胶是单体丙烯酰胺30% 双体0.8%的成品，是不是交联度不够呢？多谢指点！

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胶的浓度差不多
另外转膜的时候膜的孔径要选择0.22um的
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发表于 2013-1-19 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于如何判断转膜不成功、转过头了及短路了？能麻烦前辈讲稍详细些吗？万分感谢啦！
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 小中大


QUOTE:
原帖由 zhenxin 于 2013-1-19 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
关于如何判断转膜不成功、转过头了及短路了？能麻烦前辈讲稍详细些吗？万分感谢啦！

转完膜之后
用立春红染一下膜，看膜上有没有条带
把转移后的胶用考马斯亮蓝染一下看胶上有没有蛋白条带
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