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标题:【讨论帖】western blot问题解答

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-1-19 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好!我转膜BUFFER是TRIS 2.9g,甘氨酸5.8g,SDS1.0g,甲醇200ml定容至1000ml,转小分子湿转60V 1小时,20-55KD的可以转上,膜是MILLIPORE的0.22微米的,100V1小时40KD的也在,其他的没看,我们缓冲液的PH9左右,这是分子克隆上的配方,但我看到大部分配方甘氨酸的量要比我们大很多是2或者3倍,PH可能会在8.3左右,这个PH应该是合适的,这两种配方的影响会很大吗?我们现在100多KD 的分子做的不好,是不是可以多加甘氨酸?能不能解释一下原理?
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-1-19 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,再问几个磷酸化蛋白的问题,裂解液里没有加氟化钠,是不是磷酸化蛋白做不出来?磷酸化蛋白和相应激酶分子量一样,怎么在同一张膜上曝光,不在同一张膜上曝光怎么来比较它们?举例,测P-AKT灰度,然后除以AKT灰度得到处理组是否有磷酸化蛋白增加从而判断是否有某一个通路的参与,多谢!
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发表于 2013-1-19 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶的浓度差不多
另外转膜的时候膜的孔径要选择0.22um的

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多谢指点，再请问个问题，如果条带拖尾会有什么可能？我跑胶的时候，溴酚蓝和显影后的条带都弥散。除了上样量多以外，还有什么可能？多谢
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发表于 2013-1-19 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好!我转膜BUFFER是TRIS 2.9g,甘氨酸5.8g,SDS1.0g,甲醇200ml定容至1000ml,转小分子湿转60V 1小时,20-55KD的可以转上,膜是MILLIPORE的0.22微米的,100V1小时40KD的也在,其他的没看,我们缓冲液的PH9左右,这是分子克隆上的配方,但我看到大部分配方甘氨酸的量要比我们大很多是2或者3倍,PH可能会在8.3左右,这个PH应该是合适的,这两种配方的影响会很大吗?我们现在100多KD 的分子做的不好,是不是可以多加甘氨酸?能不能解释一下原理?

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增加0.1%SDS
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发表于 2013-1-19 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,再问几个磷酸化蛋白的问题,裂解液里没有加氟化钠,是不是磷酸化蛋白做不出来?磷酸化蛋白和相应激酶分子量一样,怎么在同一张膜上曝光,不在同一张膜上曝光怎么来比较它们?举例,测P-AKT灰度,然后除以AKT灰度得到处理组是否有磷酸化蛋白增加从而判断是否有某一个通路的参与,多谢!

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不光是NaF
还要加多种磷酸酶抑制剂
首先用内参校正，再比较
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发表于 2013-1-19 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢指点，再请问个问题，如果条带拖尾会有什么可能？我跑胶的时候，溴酚蓝和显影后的条带都弥散。除了上样量多以外，还有什么可能？多谢

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样品里离子浓度高
有沉淀
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发表于 2013-1-19 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我把目的蛋白连接到pEGFP-n1 中，
也就是表达的时候产生 N端-目的蛋白-GFP-C端 融合表达。

但是质粒转染48h后，裂解蛋白做Western Blot ，
用GFP抗体检测只有融合蛋白（左边四个泳道）这一条带，但是用目的蛋白的抗体检测却有两条带（右边三条），
一条是跟GFP抗体检测的同样大小的带，另外一条好像是目的蛋白单独大小的条带，

请问这个怎么解释，难道翻译的时候没有终止密码也会出现提取终止的情况？ 还是表达完以后融合蛋白出现断裂的情况？请赐教！

附件左为GFP抗体 右为目的蛋白特异性抗体
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发表于 2013-1-19 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问10k和250k的湿转条件，谢谢。
PS:电转仪是北京君意的
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发表于 2013-1-19 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 owanaka 于 2013-1-19 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问10k和250k的湿转条件，谢谢。
PS:电转仪是北京君意的

250K用湿转：300mA 2h10min，恒流
10K建议用半干转：1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，30min
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发表于 2013-1-19 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我把目的蛋白连接到pEGFP-n1 中，
也就是表达的时候产生 N端-目的蛋白-GFP-C端 融合表达。

但是质粒转染48h后，裂解蛋白做Western Blot ，
用GFP抗体检测只有融合蛋白（左边四个泳道）这一条带，但是用目的蛋白的抗体检测却有两条带（右边三条），
一条是跟GFP抗体检测的同样大小的带，另外一条好像是目的蛋白单独大小的条带，

请问这个怎么解释，难道翻译的时候没有终止密码也会出现提取终止的情况？ 还是表达完以后融合蛋白出现断裂的情况？请赐教！

附件左为GFP抗体 右为目的蛋白特异性抗体

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转染那一块我不懂
从条带来看你可以调整目的蛋白一抗的稀释度
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