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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-19 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人初学WB，现请教
1.我将胞浆蛋白与胞核蛋白分开提，第一次提蛋白时浓度挺高，但胞浆蛋白跑出来后（80，120）用考蓝染色，只有中分子量的条带，比较清晰，我想要的小分子量的和高分子量的都没有条带，不知是什么原因？
2.昨天又提了一次，还用Bradford法定量，胞浆蛋白浓度也挺高，但同样条件跑出来后染色除了一道Marker什么都没有，什么原因？
3.有的蛋白提取试剂盒里带有磷酸酶抑制剂，是不是就不用另加了？
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发表于 2013-1-19 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1，是你自己配制的胞浆、胞核蛋白提取试剂？
2，我们的产品提取蛋白来条带很好，想看结果通过短消息把邮箱发给我
3，看试剂盒说明书，应该了解一下具体的磷酸酶抑制剂信息，我一般用roche的磷酸酶抑制剂cocktail
挺好
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发表于 2013-1-19 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢前辈耐心的解答！还想问一下，我的蛋白是110kd，我用的条件是100v浓缩-----120V分离------100v湿转 2h，这些条件有需要改良的吗？另外，我还不明白如何恒压和恒流的选择？再次感谢哈！
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发表于 2013-1-19 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢前辈耐心的解答！还想问一下，我的蛋白是110kd，我用的条件是100v浓缩-----120V分离------100v湿转 2h，这些条件有需要改良的吗？另外，我还不明白如何恒压和恒流的选择？再次感谢哈！

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恒压与恒流的选择看个人习惯
我选择用恒流
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-1-19 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢前辈指点，看了前面的帖子，又有个问题：怎么样测定蛋白丰度啊？我们实验室作ｗｅｓｔｅｒｎ前好像从没测过。
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发表于 2013-1-19 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 taoshengyijiu 于 2013-1-19 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢前辈指点，看了前面的帖子，又有个问题：怎么样测定蛋白丰度啊？我们实验室作ｗｅｓｔｅｒｎ前好像从没测过。

不用测
查查文献
看别人文献中WB结果条带怎样基本上就有数了
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-1-19 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问大于175KD的蛋白分子量应该用多少浓度的胶老跑？
基本的实验条件是什么哪？
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发表于 2013-1-19 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
几句话说不清楚
胶浓度可以选择7.5%或8%
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发表于 2013-1-19 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主帮我解答了难题，我现在又遇到了个难题！上次我减小加样量以后，条带果然是不成线了，内参出的很好！可是我的目的蛋白不出来了！请问下楼主怎么解决这个问题啊！
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发表于 2013-1-19 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主帮我解答了难题，我现在又遇到了个难题！上次我减小加样量以后，条带果然是不成线了，内参出的很好！可是我的目的蛋白不出来了！请问下楼主怎么解决这个问题啊！

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目的蛋白的丰度比较小
你可以这样做：维持原来的上样量，上样的时候隔孔上
good luck
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