蛋白质与蛋白组学

您好！我想请教一下，我第一天跑蛋白梯度60、120、180，没有出带。第二天又跑了一个30、60、90、120的梯度。只有90和120的出了带。所以我接着跑了一个板，上样量120，一发光又什么都没有。一抗应该是没有问题的，因为别人用了出的带挺强的。一直找不到原因。能不能指教一下问题有可能出在哪里呢？
PS：蛋白大约50-60KD之间，转印100V3个小时（一般没有问题，实验室其他同胞也这样转的，更小分子量的蛋白都出来了）。封闭是2%-3%脱脂奶粉（用TBST稀释的）半个小时，2%-3%脱脂奶粉+一抗（1：400），4度过夜，2%-3%脱脂奶粉+二抗（1：5000）孵育2小时，洗膜用TBST7min3次。

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蛋白你跑过胶，染过胶吗？
我觉得你的蛋白样品可能有问题

我还想再补充一下，我第二天发出光来的那两个浓度，也是在暗房里蹲了很久（大概得一个半到两个小时）才发出荧光来，而且很微弱。别人大概浇个几分钟就出来了。这是什么原因呢？

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目的蛋白含量太低或者你的整个系统与你同学不一样
而且我认为曝光超过30min就没有意义了

LZ你好，我要做的蛋白parvalbumin分子量只有12KD，我用12%的分离胶和70V的电压，仍然没有做出，丽春红染膜可以看到蛋白条带，但是上时间（20min )也发不出荧光，同样一张膜上的内参倒是曝地很清楚。请LZ给点建议吧，谢谢了！

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内参当然会很漂亮了，内参的分子量要大于你的目的蛋白
Parvalbumin分子量才12K
需要改变的条件是：1，改用0.22um孔径的膜
2，用15%的分离胶

今天跑WB遇到一些问题，请教您，谢谢！
10%胶，fermentas 预染marker7ul，蛋白样品35ul，电泳marker条带清晰，将72-17KD的胶切下，Biorad湿转250mA 63min，PVDF膜及胶上均无marker条带，将胶考染后无条带，电转液为临用前新配，惟一不同的是今天电转是和另一同学同时用一个电泳仪串联两个槽子进行的，电流均为250mA，但电压仅为平时的一半（50v）左右，不知这个是否有影响?
Thank you!

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应该选择稳流或者稳压
你说的这种情况我没碰到过

蛋白降解问题：
以前用RIPA加cocktail，-80度保存，没有问题，后来在-20度就降解了；再后来，cocktail没有了，用PMSF，-80度，还是降解了。现在还在等待订购cocktail，不知道降解的真正原因是什么？
另外，请问有没有用过尿素裂解液啊，我试用过，老是发现有一团很粘稠的东西，很不好用！
谢谢，期待解答！

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RIPA放在4度就可以
一年稳定
cocktail在用RIPA时再加入，尽快使用
PMSF用异丙醇溶解后-20度保存就可以
在加入PMSF至RIPA中时，稳定时间为30min
尿素裂解液可以用，看你的目的蛋白