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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-26 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再问一个问题，封闭用的脱脂奶粉从超市买一包行不行啊，有没有专门的厂家，能否告知联系方式？谢谢！

===========================================

可以从超市买
脱脂奶粉就可以
如果你觉得不妥可以从试剂公司买专门的脱脂奶粉
good luck
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发表于 2013-1-26 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RIPA放在4度就可以
一年稳定
cocktail在用RIPA时再加入，尽快使用
PMSF用异丙醇溶解后-20度保存就可以
在加入PMSF至RIPA中时，稳定时间为30min
尿素裂解液可以用，看你的目的蛋白

==========================================================

我说的是用RIPA和蛋白酶抑制剂裂解的蛋白的降解，不是说裂解液本身！
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发表于 2013-1-26 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
80KDa的蛋白，用总蛋白抗体标，能否根据分子量变化判定磷酸化变化。
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发表于 2013-1-26 12:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

===============================================================================================================

我也在做VEGFR2，今天条带出来了，跟你分享一下：）
我用的是Cell signaling的抗体，做了三个浓度1：1000，1：800，1：600都出来了，推荐浓度1：1000还是不错的。个人感觉转膜是关键，第一次失败就出在转膜上，转膜条件我采纳fangweibin119前辈的意见，300mA，2.5h，转膜液里加了20%的甲醇（小分子我用的10%）和0.1%的SDS，希望对你有帮助。
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发表于 2013-1-26 12:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
头痛
你好，最近遇到个比较头疼的问题，希望你能帮我分析下原因，明天要开始做了， 希望这次结果会好！
大分子条带还行，就是小分子的条带很分散，拉得比较长，不是一个条带一样，一团黑的感觉，电泳没问题，因为Marker条带很直很清楚，就是转膜后条带不直了，不知道是什么原因，条件都跟以前一样的，就是换了一张新的膜，但还是跟以前用的是同一盒的膜，不知道会不会是膜的问题呢，打算这次换膜试试，还会不会有其他的原因呢？谢谢了！
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发表于 2013-1-26 12:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 TAT 于 2013-1-26 12:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
头痛
你好，最近遇到个比较头疼的问题，希望你能帮我分析下原因，明天要开始做了， 希望这次结果会好！
大分子条带还行，就是小分子的条带很分散，拉得比较长，不是一个条带一样，一团黑的感觉，电泳没问题，因为Marker条带很直 ...

小于20K用0.22um孔径的膜
膜也会过期
另外胶浓度多少？
不要说什么胶没有问题
对这些问题要认真分析
因为Marker是纯蛋白，条带当然会没有问题
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发表于 2013-1-26 12:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好。请问，做的时垂直电泳，上样时会看到刚加完的样品会跑到下一个上样孔中了，最后会导致两个孔中的样品体积不一样多，怎样才能避免啊。加样时也尽量的慢了~~
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发表于 2013-1-26 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小于20K用0.22um孔径的膜
膜也会过期
另外胶浓度多少？
不要说什么胶没有问题
对这些问题要认真分析
因为Marker是纯蛋白，条带当然会没有问题

==============================================================================================================

很有道理，不要主观认为这个没问题，那个没问题，要逐一排除！曾经1瓶12元的甲醇，不知道怎么回事出问题了，我从来没怀疑过它，花了一个月时间找原因，尽然就是甲醇出问题了！
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发表于 2013-1-26 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很有道理，不要主观认为这个没问题，那个没问题，要逐一排除！曾经1瓶12元的甲醇，不知道怎么回事出问题了，我从来没怀疑过它，花了一个月时间找原因，尽然就是甲醇出问题了！

=====================

任何东西的变动都要注意
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发表于 2013-1-26 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请教，电泳跑到分离胶怎么还是可以发现每个泳道的样品是分开的，而不是很均一的压成一条带呢，还有电转时间和你的分子量大小有关吗，我一般是90mA,4h.先谢谢啦！
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