蛋白质与蛋白组学

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。

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1，浓缩胶的高度一般在1cm左右，太多了会影响分离胶的高度，进而影响分离胶的分辨率
2，电泳缓冲液是不用调整pH的
建议用双蒸水新配电泳缓冲液，别调整pH

是不是糖蛋白？
如果是的话会有拖尾现象
也就是上下散开
另外要注意处理样品的过程
WB中最重要的步骤是目的蛋白的提取与处理

急求出现问题的答案
今天WB是实验以来最不顺利的一次。
大概情况如下，一抗4度过夜后，今天又在室温作用了4个小时，由于其他事，没顾上管，然后二抗2小时，洗两遍x5min，然后加发光底物等，结果在暗室整个膜很灿烂，全部发白光，GAPDH非常亮，目的蛋白根本看不清楚，试着暴了一下光，仅20秒，结果胶片显影定影后一片黑色。奇怪的是，我把膜提起来晾了一会，结果发现干了，立即放到TBST里面，发现膜上出现了一层粉末装的悬浮物，难道是膜上的蛋白干了后脱落了？
浸泡一会后，悬浮粉末不见了，我打算把膜洗一下后再杂交一次，不知行不行。我想问的问题是：
1，背景极强是不是因为一抗室温作用时间太长了？
2，那些白色的悬浮粉末到底是什么（需要注明，这一次我在一抗中加了0.05%的NaN3，一抗后TBST洗了3次x10min）
3，对常规的WB还有一些不清楚：封闭的作用是什么，封闭后需要再洗吗？一抗稀释液和封闭液一样的成分，为什么要洗？
在线等答案，谢谢了！

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1，背景强与一抗孵育时间之间的关系不是很大
建议你二抗的孵育时间缩短至40min到1h，洗膜次数适当增加
2，你说的白色悬浮物我不知道是什么东西
是不是加ECL的时候污染了？
NaN3应该不会出现这样的情况，但是我个人认为在孵育抗体的时候最好不要加入NaN3
3，NC及PVDF膜都有吸附蛋白的能力，用过量的蛋白质封闭的时候是让膜全部吸附上蛋白质，防止抗体结合的时候非特异的吸附在膜上（抗体也是蛋白质啊）
不知道说的清不清楚，继续交流

原来请教过您条带呈锯齿状的原因，我发现在提蛋白时，离心后上清的上面还有絮状物，如果不把他吸上去，就不会有锯齿状条带了！ 另外 还想请教您：western检测到了蛋白，为什么免疫组化就检测不出来呢？

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谢谢你的回复
免疫组化我不懂
检测不出来可能与抗体孵育等操作有关
希望能和你继续讨论这个问题

1，背景强与一抗孵育时间之间的关系不是很大
建议你二抗的孵育时间缩短至40min到1h，洗膜次数适当增加
2，你说的白色悬浮物我不知道是什么东西
是不是加ECL的时候污染了？
NaN3应该不会出现这样的情况，但是我个人认为在孵育抗体的时候最好不要加入NaN3
3，NC及PVDF膜都有吸附蛋白的能力，用过量的蛋白质封闭的时候是让膜全部吸附上蛋白质，防止抗体结合的时候非特异的吸附在膜上（抗体也是蛋白质啊）
不知道说的清不清楚，继续交流

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谢谢精彩回复！
我以前二抗一直反应2小时，背景情况还好吧，这次有点异常。
ECL以前作用1.5-2min，看了哈佛的WB录像，他们用5min，今天我尝试用了3min，不知道是不是原因所在。