小中大急求出现问题的答案
今天WB是实验以来最不顺利的一次。
大概情况如下,一抗4度过夜后,今天又在室温作用了4个小时,由于其他事,没顾上管,然后二抗2小时,洗两遍x5min,然后加发光底物等,结果在暗室整个膜很灿烂,全部发白光,GAPDH非常亮,目的蛋白根本看不清楚,试着暴了一下光,仅20秒,结果胶片显影定影后一片黑色。奇怪的是,我把膜提起来晾了一会,结果发现干了,立即放到TBST里面,发现膜上出现了一层粉末装的悬浮物,难道是膜上的蛋白干了后脱落了?
浸泡一会后,悬浮粉末不见了,我打算把膜洗一下后再杂交一次,不知行不行。我想问的问题是:
1,背景极强是不是因为一抗室温作用时间太长了?
2,那些白色的悬浮粉末到底是什么(需要注明,这一次我在一抗中加了0.05%的NaN3,一抗后TBST洗了3次x10min)
3,对常规的WB还有一些不清楚:封闭的作用是什么,封闭后需要再洗吗?一抗稀释液和封闭液一样的成分,为什么要洗?
在线等答案,谢谢了!
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1,背景强与一抗孵育时间之间的关系不是很大
建议你二抗的孵育时间缩短至40min到1h,洗膜次数适当增加
2,你说的白色悬浮物我不知道是什么东西
是不是加ECL的时候污染了?
NaN3应该不会出现这样的情况,但是我个人认为在孵育抗体的时候最好不要加入NaN3
3,NC及PVDF膜都有吸附蛋白的能力,用过量的蛋白质封闭的时候是让膜全部吸附上蛋白质,防止抗体结合的时候非特异的吸附在膜上(抗体也是蛋白质啊)
不知道说的清不清楚,继续交流