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我做WESTERN 遇到奇怪的问题。
要做一个100左右大小的蛋白,提取蛋白后,先煮沸,后-20度冻存。常规跑胶转膜,加抗体曝光,在需要的位置看到明显的条带,另外50-70左右还有另外一条较弱的条带。后来蛋白又重新解冻,煮沸,重做WESTERN. 这次虽然还是2条条带,可是变成了100左右较弱,50-70左右的那条较强。
问题1 为什么2次结果不一样?
2 上样前煮沸,或者提取蛋白后立刻煮沸冻存,上样前再解冻再次煮沸有区别吗?
还有一个怪现象
我曾经作过几个分泌性蛋白,如IL-10。抗体说明书上指示目标蛋白在20KB左右,可是我做出来在50KB左右有明显条带,20左右没有看到。追溯文献,几乎所有文献都是用ELISA来检测。极少看到用WESTERN的报道。
问题1 为什么我的条带的位置不对?
2 是不是有些蛋白不适合WESTERN?怎样判定适合不适合?
谢谢