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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-30 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补充一下，我用的是15%的分离胶，电泳1个小时，caps buffer转膜液，100mA,一个小时左右，只能看到15kd的条带，看不到6.9kd的条带
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-1-30 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：
我用贴壁细胞BMN作western，24孔板培养，处理之后用碧云天的RIPA裂解液裂解细胞，然后用来做western，我要杂的抗体是4ebp磷酸化，结果什么都没有，但是我的阳性对照组织样品有我的目的条带，表明western操作没有错误，但是为什么细胞样品没有呢？我测了细胞样品的蛋白浓度非常低，0.2~0.6ug/ul，我上样30ul左右。请问是不是因为细胞样品的蛋白含量过低造成的。
还有一个很奇怪的问题，在杂4ebp磷酸化（15kd）的同时，我把膜剪成两半，另一半用来杂actin(45kd),结果是actin一条条带都没有，组织的也没有。我用的actin抗体是1：4000稀释的，转膜30v过夜。请问这是什么原因。
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发表于 2013-1-30 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
western问题求助
蛋白分子量6.9KD，等电点12左右，有磷酸化和非磷酸化两种形式，每次做western只能杂到磷酸化的15KD左右条带，这与文献上讲的磷酸化后的大小一致，但是总是杂不到正常大小即6.9KD左右的条带，一抗是用肽段做的抗体，应该是同时能杂到磷酸化和分磷酸化的，郁闷死了，技术瓶颈，试验拖了大半年，楼主有没有建议

=================

6.9K不好做
用Tricine系统
我没做过这么小的
不好意思
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发表于 2013-1-30 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是caps转膜buffer，查过网上说小分子量蛋白转膜要加甲醇，而且甲醇浓度要稍高，利于小分子量蛋白的转膜，但是碱性蛋白转膜是不能用甲醇的，我就被郁闷到了，像我做这个蛋白，分子量又小，等电点又高，到底转膜该用什么进行转膜？

================================

要查有关这个蛋白已经发表的正式文献
看人家用的什么系统及buffer
我经常上Highwire搜
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发表于 2013-1-30 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教：
我用贴壁细胞BMN作western，24孔板培养，处理之后用碧云天的RIPA裂解液裂解细胞，然后用来做western，我要杂的抗体是4ebp磷酸化，结果什么都没有，但是我的阳性对照组织样品有我的目的条带，表明western操作没有错误，但是为什么细胞样品没有呢？我测了细胞样品的蛋白浓度非常低，0.2~0.6ug/ul，我上样30ul左右。请问是不是因为细胞样品的蛋白含量过低造成的。
还有一个很奇怪的问题，在杂4ebp磷酸化（15kd）的同时，我把膜剪成两半，另一半用来杂actin(45kd),结果是actin一条条带都没有，组织的也没有。我用的actin抗体是1：4000稀释的，转膜30v过夜。请问这是什么原因。

================================

你上样的时候总蛋白含量太低了
另外这么小的蛋白用0.22um孔径的膜
转膜建议用半干转
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发表于 2013-1-30 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教老师帮我分析下问题出在那里

我的蛋白为膜蛋白 为组成型

大小 二聚体为260 KD 亚基为130KD

细胞用RIPA buffer抽提

我做的western blot是低温的SDS-PAGE,

上样前要求总蛋白未煮
上样50－200ug

凝胶浓度为7.5％
转膜条件为：400mA 80分钟（转膜效果差）

5％脱脂奶粉封闭 RT 1 h

洗脱3次每次5分钟

一抗为1：200－1：1000
二抗为1：4000
ECL 反应2 min
曝光2 min-overnight
不能看到 二聚体或者亚基的任何一条带
请问我的问题出现在那里？怎么解决？
谢谢
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发表于 2013-1-30 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2013-1-30 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教老师帮我分析下问题出在那里

我的蛋白为膜蛋白 为组成型

大小 二聚体为260 KD 亚基为130KD

细胞用RIPA buffer抽提

我做的western blot是低温的SDS-PAGE,

上样前要求总蛋白未煮
上样50－200ug

凝胶浓度为7.5 ...

蛋白上样前需要加buffer后煮，变性
最大的可能就是你的膜蛋白没有提取出来
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发表于 2013-1-30 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2013-1-30 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教老师帮我分析下问题出在那里

我的蛋白为膜蛋白 为组成型

大小 二聚体为260 KD 亚基为130KD

细胞用RIPA buffer抽提

我做的western blot是低温的SDS-PAGE,

上样前要求总蛋白未煮
上样50－200ug

凝胶浓度为7.5 ...

建议你用提膜的试剂盒
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-1-30 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，用NC膜点样的方法检测一抗是否失效具体该如何操作？谢谢
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发表于 2013-1-30 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，用NC膜点样的方法检测一抗是否失效具体该如何操作？谢谢

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孵育一抗，二抗，曝光或者显色
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