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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-30 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用你的裂解液孵育后
加入loading buffer，煮5min
离心取上清试试
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youyou99[使用道具]
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发表于 2013-1-30 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师：
我先前做了一次westernblot ，抗体是国产博士德的，目标蛋白也做出来了，可是其他的地方背景太深，虽然不影响定量分析，但是感觉图片的结果不理想，现准备重做，请各位老师指导一下问题出在哪里了？谢谢啊！
是不是因为抗体是国产的原因啊？
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发表于 2013-1-30 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 youyou99 于 2013-1-30 12:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老师：
我先前做了一次westernblot ，抗体是国产博士德的，目标蛋白也做出来了，可是其他的地方背景太深，虽然不影响定量分析，但是感觉图片的结果不理想，现准备重做，请各位老师指导一下问题出在哪里了？谢谢啊！
是不是因为抗体是国产 ...

一抗会有影响
延长一下封闭时间
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发表于 2013-1-30 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前辈想请教一下，加了发光剂要完全吸干表面残余的发光剂吗？加发光剂要避光或是封闭起来吗？还是就裸在空气中？不胜感激！！！
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发表于 2013-1-30 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2013-1-30 12:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前辈想请教一下，加了发光剂要完全吸干表面残余的发光剂吗？加发光剂要避光或是封闭起来吗？还是就裸在空气中？不胜感激！！！

不用完全吸干
把膜放在保鲜膜上，提起一角，吸水纸在膜的一侧把ECL吸走，注意吸水纸不要放在膜上
加了发光剂在正常情况下进行就可以
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发表于 2013-1-30 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那么如果完全吸干会有什么后果呀？
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发表于 2013-1-30 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2013-1-30 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那么如果完全吸干会有什么后果呀？

荧光会消失
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发表于 2013-1-30 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
啊，是这样啊，难怪我跑的是空白，就是把保鲜膜上的发光剂吸掉就可以了，膜的表面还是要留一层发光剂是吧，然后用另一层保鲜膜夹好就可以显影了是吧？
另外问个可能比较弱智的问题，你们说的染膜和染胶是什么呀？我们这边好像都不染的呢，染过后继续做会影响结果吗？
抗体可以重复使用吗？
非常感谢哦。。。
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发表于 2013-1-30 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位高手大家好
我从组织提的蛋白，分子量18kd，电泳后200mA 1小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，一抗 1：100（师兄以前做出来的多抗）室温孵育2h/4°C孵过夜，二抗1：2000稀释室温孵育1小时，最后用DAB显色，做过十多遍了，marker带都转上了，但目的带始终没转上，转完膜后对胶染色未见蛋白条带，电泳后胶染色可以看到目的带


请各位帮忙分析一下，是什么原因，谢谢大家了！
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发表于 2013-1-30 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
啊，是这样啊，难怪我跑的是空白，就是把保鲜膜上的发光剂吸掉就可以了，膜的表面还是要留一层发光剂是吧，然后用另一层保鲜膜夹好就可以显影了是吧？
另外问个可能比较弱智的问题，你们说的染膜和染胶是什么呀？我们这边好像都不染的呢，染过后继续做会影响结果吗？
抗体可以重复使用吗？
非常感谢哦。。。

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染膜：指用立春红等染NC、PVDF膜
染胶：指用考马斯亮蓝R-250等染料染PAGE胶
我不建议重复使用抗体
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