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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-30 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位高手大家好
我从组织提的蛋白，分子量18kd，电泳后200mA 1小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，一抗 1：100（师兄以前做出来的多抗）室温孵育2h/4°C孵过夜，二抗1：2000稀释室温孵育1小时，最后用DAB显色，做过十多遍了，marker带都转上了，但目的带始终没转上，转完膜后对胶染色未见蛋白条带，电泳后胶染色可以看到目的带


请各位帮忙分析一下，是什么原因，谢谢大家了！！！！

====================

转移时间缩短至30min
换0.22um的膜
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发表于 2013-1-30 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想请教一个问题，我要检测的目的蛋白是30KDA，会不会出现目的条带出现在26KDA（依据MARKER）的位置？
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发表于 2013-1-30 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位大侠，我是一新手，想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是：磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果，从细胞当中提取蛋白时，我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢？有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白？不知道表述清楚了没有，万分感谢~~~~
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发表于 2013-1-30 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很感谢你的耐心回答，想请教一个问题，我要检测的目的蛋白是30KDA，会不会出现目的条带出现在26KDA（依据MARKER）的位置？

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你的结果没有问题
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发表于 2013-1-30 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位大侠，我是一新手，想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是：磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果，从细胞当中提取蛋白时，我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢？有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白？不知道表述清楚了没有，万分感谢~~~~

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最好的确定方法是看你的方向的专业文献
影响因子高的
你的蛋白定位在那呢？
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发表于 2013-1-30 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一个问题，我要检测的目的蛋白是30KDA，会不会出现目的条带出现在26KDA（依据MARKER）的位置？
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发表于 2013-1-30 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位大侠，我是一新手，想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是：磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果，从细胞当中提取蛋白时，我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢？有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白？不知道表述清楚了没有，万分感谢~~~~
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发表于 2013-1-30 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助：BIO-RAD的电泳仪，100V恒压，电泳时电泳槽出现大量雾气，marker的95和72条带老是跑不开，两条带连在一起。电泳液和胶都和以前一样，以前marker的10条带清晰可见。求助原因。谢谢各位！

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电泳时温度太高
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发表于 2013-1-30 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助：BIO-RAD的电泳仪，100V恒压，电泳时电泳槽出现大量雾气，marker的95和72条带老是跑不开，两条带连在一起。电泳液和胶都和以前一样，以前marker的10条带清晰可见。求助原因。谢谢各位！
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发表于 2013-1-30 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好：我想看看转染了基因的细胞株中cyclinD1和CDK4的表达情况，因为这两个都是核表达的，不知道用RIPA常规提取的蛋白能不能用？还是非要提核蛋白来做呢？非常感谢！
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