蛋白质与蛋白组学

上样量的大小取决于上样孔大小，一般蛋白的上样量为40-75UG.

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你说的很对
不同的孔数与胶厚度都会影响上样量大小

1，蛋白上样量有点大，减小一倍
2，分子量多大？
3，加大一抗稀释比例至1：10000到1：20000

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（1）我的蛋白分子量约26kd，不知转膜时间是否不合适？
（2）我们曾经将一抗的稀释比例到1：8000，结果是我们的目的条带更淡了。

（1）我的蛋白分子量约26kd，不知转膜时间是否不合适？
（2）我们曾经将一抗的稀释比例到1：8000，结果是我们的目的条带更淡了。

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确认你的Marker是否正确

（1）我的蛋白分子量约26kd，不知转膜时间是否不合适？
（2）我们曾经将一抗的稀释比例到1：8000，结果是我们的目的条带更淡了。

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不知道你的Tag转染的如何

请教一下，同样的样品，用尿素和RIPA分别裂解，然后同样的条件做western，结果出来怎么差别那么大？该以哪个为准？
谢谢！

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我认为两种差不多
曝光时间稍长一点
RIPA的结果就会与Urea的一样
看你是什么样品了
我一般是用RIPA

下图是我作的western blot图片。目的蛋白是含His tag的重组蛋白，SDS-PAGE显示均没有任何问题。western blot条件：（1）电泳上样10ul（1ml菌液离心后加100ul 上样缓冲液）；（2）NC膜为密里博产品；（3）转膜为60v转2h；（4）5％脱脂奶粉 RT 封闭1h；（5）PBS洗4次，每次10min；（6）加1抗（抗His tag单抗，天根生化）1:5000，4度，过夜；（7）PBST洗4次，每次10min；（8）加2抗（HPR标记，天根生化）1：500，RT，1h；（9）PBST洗4次，每次10min；（10）HRP-DAB显色试剂盒显色（天根生化）。结果：（1）有很多杂带；（2）目的带弱（SDS-PAGE显示目的蛋白表达水平占40％左右）。请问该如何优化条件？

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我认为你的marker有问题
那么宽的条带怎么确认位置啊