蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  63/610 |‹‹‹61626364656667686970›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
621

发表于 2013-1-30 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现跑一细胞蛋白样，电用完之后（肉眼可见溴酚蓝已经跑到胶下缘），用考马斯亮蓝染色过夜后，结果发现蛋白条带都在胶上边（靠近基层胶端），胶的下半面空白。---------这是怎么回事？？？
基层胶电压80v，20多毫安，分离胶120v，50-70毫安之间，共约2小时，基层胶压缩的自认为还可以，可以看到压得比较紧。
请高手指点一下，本人要做的是十几kd的小分子量蛋白，对于以上的情况给与解答？万分感谢！

===========================================

我没碰到过这种情况
但是我感觉是你的分离胶与浓缩胶用的缓冲液出了问题
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
622

发表于 2013-1-30 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好
最近我在做3个蛋白。大小大概是80.90.110，用HepG2细胞提的。浓度2-3UG/UL,每孔加的15UL左右。
我的试验条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜 湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时

B -ACTIN跑出来过，但是这三个蛋白只做出来一次，还是80的。90，110的都没跑出来。一直在预试验摸条件，以前没做过，想请您针对我的蛋白给个好的试验条件。转移液配方甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000.您说得加转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?
还有我的TBST用得是0.5ML的吐温加1000ML的TBS。
谢谢您给点意见。尤其是我的试验条件有没有需要改进的地方？膜选用PVDF会更好吗？封闭前需要对膜做正反标记么？
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
623

发表于 2013-1-30 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好
最近我在做3个蛋白。大小大概是80.90.110，用HepG2细胞提的。浓度2-3UG/UL,每孔加的15UL左右。
我的试验条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜 湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时

B -ACTIN跑出来过，但是这三个蛋白只做出来一次，还是80的。90，110的都没跑出来。一直在预试验摸条件，以前没做过，想请您针对我的蛋白给个好的试验条件。转移液配方甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000.您说得加转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?
还有我的TBST用得是0.5ML的吐温加1000ML的TBS。
谢谢您给点意见。尤其是我的试验条件有没有需要改进的地方？膜选用PVDF会更好吗？封闭前需要对膜做正反标记么？

==================================

呵呵
真有缘
我正在做HepG2细胞的实验
已经做完一批，现在做第二批，72个样品
我做AMPK与phospho-AMPK
要做膜的正反标记
应该在转膜的时候做
我现在用NC，以前用PVDF膜几年
膜没有什么大的区别
转膜后染膜了？
另外一抗的厂家与建议稀释比例是多少？
顶部
101010[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75120
精华 0
积分 517
帖子 734
信誉分 100
可用分 4490
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
624

发表于 2013-1-30 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
新手上路，请帮忙

问题：
1.我做gapdh做内参，样品十五个，第一次跑的时候和一个目的蛋白同时孵育，目的蛋白出来少部分且条带较淡，gapdh出来了，但分不清十几个了，连在一起且条带较浓，我单独跑gapdh减少上样量一半以后（10微克）后跑出来后条带还是较浓，但仍然不能全部跑出来。为了看看是不是样品的体，我使用一种样品点了15个泳道，结果还是不能全部做出来，只能跑出一部分，怎样改善才能全部做出来，谢谢。另外怎样使目的带更清晰一些？
2.我使用的PVDF膜孵育过一个抗体后（已经用ECL显色且效果可以），换能重新封闭膜后孵育另一个抗体吗？我想看看同一张膜上这几种蛋白的变化，因为在如果同一张膜看两个蛋白的变化，对照性更可靠些（个人观点）
3.我的部分蛋白分子量在35----45之间，bio-red半干转 PVDF膜一般转多长时间比较合适啊，谢谢
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
625

发表于 2013-1-30 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 101010 于 2013-1-30 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
新手上路，请帮忙

问题：
1.我做gapdh做内参，样品十五个，第一次跑的时候和一个目的蛋白同时孵育，目的蛋白出来少部分且条带较淡，gapdh出来了，但分不清十几个了，连在一起且条带较浓，我单独跑gapdh减少上样量一半以后（10微克）后跑出 ...

1，转膜的时候胶与膜之间有气泡
2，孵育抗体的时候液体没有完全覆盖膜表面
3，如果你用stripping buffer洗掉抗体的话要重新封闭
否则直接加抗体即可
4，转膜时间，半干 1.2mA每平方厘米膜面积，1h
good luck
顶部
DNA[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73137
精华 1
积分 429
帖子 494
信誉分 102
可用分 3291
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-19
状态 离线
626

发表于 2013-1-30 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1，转膜的时候胶与膜之间有气泡
2，孵育抗体的时候液体没有完全覆盖膜表面
3，如果你用stripping buffer洗掉抗体的话要重新封闭
否则直接加抗体即可
4，转膜时间，半干 1.2mA每平方厘米膜面积，1h
good luck

============================================================

感谢解答,
1.每次做赶气泡工作做得很好，转膜后染胶后发现，目的带基本都染在膜上了
2.孵育抗体液体绝对充分，用量双面覆盖应该也没问题了。
还有其他因素吗？或者是膜边缘的原因，因为每次边上两个跑的都不死很好。
顶部
windy+++[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74130
精华 0
积分 490
帖子 720
信誉分 100
可用分 4343
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
627

发表于 2013-1-30 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢解答,
1.每次做赶气泡工作做得很好，转膜后染胶后发现，目的带基本都染在膜上了
2.孵育抗体液体绝对充分，用量双面覆盖应该也没问题了。
还有其他因素吗？或者是膜边缘的原因，因为每次边上两个跑的都不死很好。

========================================

检查一下膜是否过期
如果这些原因都排除了把样品顺利调换一下试试
顶部
131415[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74126
精华 0
积分 565
帖子 789
信誉分 100
可用分 4798
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
628

发表于 2013-1-30 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵
真有缘
我正在做HepG2细胞的实验
已经做完一批，现在做第二批，72个样品
我做AMPK与phospho-AMPK
要做膜的正反标记
应该在转膜的时候做
我现在用NC，以前用PVDF膜几年
膜没有什么大的区别
转膜后染膜了？
另外一抗的厂家与建议稀释比例是多少？

=============================================================================================================

谢谢老师的解答，一抗我用的博士德的，建议比例是1：100-500，STAT1针对84和91KD,STAT2针对110KD的，我染了，用丽春红染的，不明显，但是今天曝光时暴出来了，在80-95之间，只有一条，应该是2条，会不会84和91过于接近不好跑开呢。
还有个很重要的问题希望老师解答就是我的实验条件有没有大的问题？
条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜 湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时
转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?转移液需要改进吗？我的是甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
629

发表于 2013-1-30 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢老师的解答，一抗我用的博士德的，建议比例是1：100-500，STAT1针对84和91KD,STAT2针对110KD的，我染了，用丽春红染的，不明显，但是今天曝光时暴出来了，在80-95之间，只有一条，应该是2条，会不会84和91过于接近不好跑开呢。
还有个很重要的问题希望老师解答就是我的实验条件有没有大的问题？
条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜 湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时
转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?转移液需要改进吗？我的是甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000

======================================================

你的实验条件没有大问题，建议你细化每个步骤
我觉得已经很好了
不知道你的结果如何
可以发给我看看
另外你有没有染胶，跑完SDS-PAGE的胶
看看总蛋白提取的如何
条带挨着很近可能是电泳没有分开，取决于分离胶浓度，电泳时间等
祝你顺利
顶部
98776langtao[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74068
精华 0
积分 275
帖子 290
信誉分 100
可用分 2191
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
630

发表于 2013-1-30 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师，我今天做的目的条带弱，marker却有很亮的条带，怎么回事啊？还有一个蛋白是整膜都亮，目的条带还是有的，不知道怎么能不让整张膜都发光呢，二抗已经用到了1：8000，做GAPDH同样的二抗用的1：2000呢，谢谢啊
顶部
 6097  63/610 |‹‹‹61626364656667686970›››|