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标题:【讨论帖】western blot问题解答

wood533[使用道具]
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发表于 2013-1-30 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
怎么样的结果算是合适的二抗稀释度呢？

=========================================================

比如1：1000，1：2000，1：4000
要是这三个稀释度中都能出结果1：1000强，1：2000中等，1：4000弱
那就要选择一个浓度比较合适的，在这选择1：2000
实际WB中如果选择1：4000可能会出不了结果，1：1000浓度又太高
这个点膜实验可以测定ECL的敏感性与二抗的稀释度
说的不是很清楚，不知道怎么表达
建议你自己实际做了之后再讨论
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2013-1-30 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

=========================================================

我觉得是胶板夹得太紧了的原因，是不是在转移胶板的时候才会出现气泡
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2013-1-30 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白？
加入纯化好的beta-actin？
我觉得行不通

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很多人用过柱子的方法浓缩培养上清的蛋白，效果还不错
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xyw5[使用道具]
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发表于 2013-1-30 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：我现在用的一抗Caspase-3（cell signaling），可以检测酶原和激活后的片段17KD。但是我做出来的32KD条带比较细，17KD条带做不出来，其他目的蛋白条带还是很粗的。跑胶转膜没有问题。请问怎样使Caspase-3条带变粗？我加大上样量延长暴光时间还是不行。我按说明书上用1：1000稀释比。请问我该怎么办？
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发表于 2013-1-31 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好,在电泳后要转膜时,切胶老是切不好,在显影后发现泳道上不对,该如何解决此问题?有时发现预染MARKER的周围就是自己需要的条带,切下转膜加抗体后,发现有多条带?该如何选择是哪一条呢?为什么有多条带?谢谢
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发表于 2013-1-31 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xyw5 于 2013-1-30 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问：我现在用的一抗Caspase-3（cell signaling），可以检测酶原和激活后的片段17KD。但是我做出来的32KD条带比较细，17KD条带做不出来，其他目的蛋白条带还是很粗的。跑胶转膜没有问题。请问怎样使Caspase-3条带变粗？我加大上样 ...

用1：500试试了
另外你要考虑下你的样品在处理过程中有没有可能使caspase-3 17K降解
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-1-31 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,在电泳后要转膜时,切胶老是切不好,在显影后发现泳道上不对,该如何解决此问题?有时发现预染MARKER的周围就是自己需要的条带,切下转膜加抗体后,发现有多条带?该如何选择是哪一条呢?为什么有多条带?谢谢

===========================================================

多条带的原因主要与一抗有关
加大一抗的稀释度，让一抗变稀
另外你要想切得准确的话要把预染M与非预染M同时作比较，看两者的位置
预染M的泳动位置只能作为参考
要用非预染M来确认具体位置
祝你实验顺利
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发表于 2013-1-31 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想做一个8KDa的蛋白，请问分离胶用15％的行吗？15％的胶的配方是什么？转膜时湿转应该用多大电压，多长时间？非常感谢！
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发表于 2013-1-31 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问，Westen Blot的灰度值结果需要做统计学分析吗？如何分析呢？
谢谢~
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3N4G[使用道具]
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发表于 2013-1-31 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问LZ有没有跑过neurocan 这类蛋白，如果我要跑150kDa的蛋白，跑胶和转膜的条件怎么选择？多谢！
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