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标题:【讨论帖】western blot问题解答

www.1[使用道具]
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1、我想请教一下,我在用封闭液洗膜的时候,发现PVDF膜表面变花了,如墙壁的石灰脱落,完全脱落后就变得透明,请问这是什么原因引起的?
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QUOTE:
原帖由 www.1 于 2013-1-31 14:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、我想请教一下,我在用封闭液洗膜的时候,发现PVDF膜表面变花了,如墙壁的石灰脱落,完全脱落后就变得透明,请问这是什么原因引起的?


膜过期了
或者是没有活化好
用无水甲醇活化 10s即可
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newway[使用道具]
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相关疾病:
肺癌类风湿关节炎
最近准备做western blot ,在配制不连续转移缓冲液的时候需要CAPS这一试剂,但这个试剂好像很少,不大有得买,而且据说很贵。
听说可以用甘氨酸代替,如果可以用甘氨酸代替,那配制时各成分的浓度是多少?是60 mM Tris,40 mM 甘氨酸,pH 9.6吗?
请教fangweibin119老师,不胜感激!
To prepare 100 ml of each working buffer from the 5x stock solution
(final concentration 60 mM Tris,40 mM CAPS,pH 9.6):
Anode (bottom) buffer:
20 ml 5x Tris/CAPS
15 ml MeOH
65 ml water

Cathode (top) buffer:
20 ml 5x Tris/CAPS
1 ml 10% SDS
79 ml water
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NBA[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 newway 于 2013-1-31 14:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病:
肺癌类风湿关节炎
最近准备做western blot ,在配制不连续转移缓冲液的时候需要CAPS这一试剂,但这个试剂好像很少,不大有得买,而且据说很贵。
听说可以用甘氨酸代替,如果可以用甘氨酸代替,那配制时各成分的浓度是 ...

你做什么蛋白啊
能把文献发给我看看吗?
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tuuu2[使用道具]
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你好,我内参是贝塔actin,目的蛋白分子量为59KD,内参是小鼠抗大鼠,目的蛋白也是小鼠抗大鼠,我在加一抗时能否一起加。我的二抗都是羊抗小鼠的,也能一起加吗?因为我想将内参与目的蛋白在一张膜上显影。行吗?
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相关疾病:
Barrett食管大动脉炎

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你好,我内参是贝塔actin,目的蛋白分子量为59KD,内参是小鼠抗大鼠,目的蛋白也是小鼠抗大鼠,我在加一抗时能否一起加。我的二抗都是羊抗小鼠的,也能一起加吗?因为我想将内参与目的蛋白在一张膜上显影。行吗?

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beta-actin分子量是45KD
可以一起做
但是要两个分别摸条件
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ritou1985[使用道具]
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我想请教您一些问题:
关于蛋白marker,我用的是ferments的1811,有两条红色带的那种,跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶,在电泳的时候,marker只有40多及以上的能分开,28及以下的marker全都挤在一起,跑不开,即使是跑到底了也没有分开,跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题,后来重新滴定调整,也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白,但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开,明天就跑不开了,根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的,并没有大的变化。

谢谢您的指点。
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我想请教您一些问题:
关于蛋白marker,我用的是ferments的1811,有两条红色带的那种,跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶,在电泳的时候,marker只有40多及以上的能分开,28及以下的marker全都挤在一起,跑不开,即使是跑到底了也没有分开,跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题,后来重新滴定调整,也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白,但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开,明天就跑不开了,根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的,并没有大的变化。

谢谢您的指点。

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28K左右的蛋白不能算是很小的蛋白
10K以上在12%的分离胶是可以很好的分开的
你的分离胶高度有多少?
是不是因为分离胶高度太小引起的不能完全分离?
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fox_79[使用道具]
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我最近开始做WB,但是结果很不好,特来请教。
1.同样的样品,我做点杂交是有显影的,做Wetern则没有信号,抗体和ECL显影系统应该没有问题的,实验室其他人用同样的系统结果就很不错。可能的原因是什么呢?我怀疑是蛋白降解了,我用的是尿素方法抽提的蛋白。
2.另外一个问题,一开始做不都是要模索条件嘛,二抗的点杂交做起来应该比较简单。那一抗的稀释比例怎么摸呢?
具体一点,是用同样的蛋白样品,分别点在几张不同的NC膜上,这些膜再在不同一抗条件下孵育吗
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我最近开始做WB,但是结果很不好,特来请教。
1.同样的样品,我做点杂交是有显影的,做Wetern则没有信号,抗体和ECL显影系统应该没有问题的,实验室其他人用同样的系统结果就很不错。可能的原因是什么呢?我怀疑是蛋白降解了,我用的是尿素方法抽提的蛋白。
2.另外一个问题,一开始做不都是要模索条件嘛,二抗的点杂交做起来应该比较简单。那一抗的稀释比例怎么摸呢?
具体一点,是用同样的蛋白样品,分别点在几张不同的NC膜上,这些膜再在不同一抗条件下孵育吗?

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1,点杂交只能作参考,假阳性比较多
2,一抗的稀释度要通过完整的WB来确定
样品转膜后把膜剪成小条,每条用不同的一抗稀释度
good luck
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