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标题:【讨论帖】western blot问题解答

TNT[使用道具]
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谢谢你的这么多精彩解答.
我在实验中碰到一个关于样本处理的问题,我们的样本是分支杆菌,因其胞壁的特殊结果,较其他细菌致密一些.我们使用超声处理后的样本来做sds-page结果条带很少,后又在超声体系中加入PMSF,仍然没有改善。比较奇怪的是,同样的样本做2-D电泳时却有很多点,请帮忙分析一下可能的原因,谢谢!
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QUOTE:
原帖由 TNT 于 2013-1-31 14:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢你的这么多精彩解答.
我在实验中碰到一个关于样本处理的问题,我们的样本是分支杆菌,因其胞壁的特殊结果,较其他细菌致密一些.我们使用超声处理后的样本来做sds-page结果条带很少,后又在超声体系中加入PMSF,仍然没有 ...

加PMSF是为了防止蛋白降解
建议改用合适的蛋白提取试剂
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NBA[使用道具]
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谢谢你的这么多精彩解答.
我在实验中碰到一个关于样本处理的问题,我们的样本是分支杆菌,因其胞壁的特殊结果,较其他细菌致密一些.我们使用超声处理后的样本来做sds-page结果条带很少,后又在超声体系中加入PMSF,仍然没有改善。比较奇怪的是,同样的样本做2-D电泳时却有很多点,请帮忙分析一下可能的原因,谢谢!

====================

测过浓度没有?
是不是上样量很低?
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qqq111[使用道具]
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最近在做western遇到一个奇怪的问题,检测细胞上清蛋白,actin泳道为细胞裂解,上清中没有杂到actin正常。目的蛋白为14kd,但是试验中检测到目的蛋白约24kd,而且买的标准品也在24kd上面有条带。而下面整个成一条线,但理论上目的蛋白大致在成一条线的位置,但是这又与实验处理相矛盾。因为只有右面4个泳道会有条带
1.蛋白偏大(24kd)是什么原因?
2.下面整个成一条线是什么原因照成(抗体是多抗)。
3.实验条件该怎样优化?
4.发表文章的话下面那整个一条线剪切掉可以吗?把其它地方背景减弱这属于学术不端吗?谢谢!
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vera+[使用道具]
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大家好!
我们实验室最近遇到这样的问题:
实验条件:上样305ul/泳道,电泳:80V30min,120V70-75min。buffer14.4g甘氨酸,3.02gTris,10%SDS10ml,定容到1L。
预染Marker,170、130、100、72、55、40、33、*、14.4。
电泳过程中,溴芬兰指示标记进入分离胶很整齐,marker分离也没问题。随着电泳时间的增加,marker越来越淡,最后72及其以上的条带均丢失。
郁闷,同一个实验体系,这种现象时有时无。
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pengke1983[使用道具]
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我想请教您一些问题:
关于蛋白marker,我用的是ferments的1811,有两条红色带的那种,跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶,在电泳的时候,marker只有40多及以上的能分开,28及以下的marker全都挤在一起,跑不开,即使是跑到底了也没有分开,跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题,后来重新滴定调整,也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白,但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开,明天就跑不开了,根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的,并没有大的变化。

谢谢您的指点。

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28K左右的蛋白不能算是很小的蛋白
10K以上在12%的分离胶是可以很好的分开的
你的分离胶高度有多少?
是不是因为分离胶高度太小引起的不能完全分离?

谢谢您的指点,
分离胶的高度很大,因为浓缩胶只在梳子以下一厘米,所以我也觉得很奇怪,不知道是哪里出了问题。
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mamamiya[使用道具]
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请教一westernblot问题,上样时上样缓冲液的最终浓度应该是x 多少倍?我的总体系是20微升,因为我组织蛋白含量较高,组织蛋白体积为5微升,我该如何办?上样时蛋白的含量最好为多少?不胜感谢!
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yonger[使用道具]
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您好,想请教您个问题,无论加多大的抗体,出来的结果都在55KD的位置。考马斯染过之后,蛋白是完整的。请问是什么原因呢?谢谢!
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ladyhuahua[使用道具]
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请问,我最近做了些western,
小分子量的比如说21kd、20kd和16kd的P21、bax、survivin就都没有作出来。很迷惑。
我的条件是:上样总蛋白75ug,配10%的胶,电泳时最小为10kd的marker还留着,PVDF转膜湿转300mA 1h或350mA 1.5h都试过,封闭后一抗过夜。TBST洗膜,二抗1.5h,TBST洗膜。而后ECL显影。

内参37KD的GAPDH没有问题。条带很浓。但是小分子的P21,bax,survivin都没有出来。

我仔细搜索了版内大家的讨论:
对于转膜时间和电流大小 没有一致的看法:有人认为半个小时,200mA就够了。也有人转2h。有人用恒压转。
我一直都用恒流350mA转膜1.5h的,转30kd以上都没有问题。因为现在要做的是小分子,所以调成300mA 1h试过,虽然GAPDH可以出来,但目的蛋白没有。想问转膜条件到底应该如何?PVDF膜理论上应该不会使得蛋白转过头吧?
我需要做怎样的调整。
我今天做,自己初步的调整如下:
1、胶配成12%
2、加大上样蛋白量150ug
3、转膜时间是否也需要再减少?

Bax与Bcl-2我刚做完
骨骼肌来源的
可以用15%的分离胶
最好用0.22um的膜
转膜时间300mA 1h,注意降温

你好,我现在也要做bcl-2,我想问一下.1.提蛋白的试剂是用提总蛋白,还是用其它的.
2.一抗用rabbit抗人的,mouse抗人的有没有区别.3,你的二抗用的是什么标记的,效果怎么样.
谢谢!
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eric930[使用道具]
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在wb过程中发现 我的条带连在一起了 并且加marker的那孔中也有目的蛋白检出
我配置的蛋白胶是10%的
分离胶:
H2O 4ml
4XBuffer(Tris-SDS pH 8.8) 2ml
40%丙烯酰胺 2ml
10%APS 100ul
TEMED 10ul

浓缩胶:
H2O 2.5ml
4XBuffer pH6.8 1ml
40%丙烯酰胺 0.5ml
10%APS 40ml
TEMED 4ul

电泳100V
转膜 300mA 90min

我上样量为15ug总蛋白 差不多没孔是12ul左右
我觉得好像不是上样量的问题 以前没有遇到过这个状况
而且用了santa的抗体出现了两条带

我做了2次了 都是这样
请老师 在百忙之中指点迷津
万分感谢
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