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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-1 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
骨关节炎大动脉炎

================================

我还是每太看懂
裂解液是要有所变化的
不同的目的蛋白不能采用同一种裂解液

==========================================================================================================

我的意思是说提PBMC时 PBMC和红细胞在一起，需要用红细胞裂解液裂红的。我担心红细胞裂解液在裂红的同时会对PBMC有影响，进而影响下一步我从PBMC提蛋白来做WESTERN

我用的提蛋白的裂解液是自己订购的。一般都是用它。直接加48UL此种裂解液+12UL DTT+60UL的2X LOADING BUFFER，总体积120UL，再2UL样本+18UL水+1ML的考嘛斯亮蓝去测浓度。用这种裂解液提蛋白，STAT1做出来了，STAT2没做出来，我觉得您说的是对的，也许就是理解液的原因导致实验失败、

谢谢老师
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发表于 2013-2-1 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的意思是说提PBMC时 PBMC和红细胞在一起，需要用红细胞裂解液裂红的。我担心红细胞理解液在裂红的同时会对PBMC有影响，进而影响下一步我从PBMC提蛋白来做WESTERN

===================================

哦
懂了
你裂解的时候肯定会有影响
这个过程应该控制在PBMC细胞的收集上
在裂解的时候是控制不了的
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发表于 2013-2-2 09:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的意思是说提PBMC时 PBMC和红细胞在一起，需要用红细胞裂解液裂红的。我担心红细胞裂解液在裂红的同时会对PBMC有影响，进而影响下一步我从PBMC提蛋白来做WESTERN

我用的提蛋白的裂解液是自己订购的。一般都是用它。直接加48UL此种裂解液+12UL DTT+60UL的2X LOADING BUFFER，总体积120UL，再2UL样本+18UL水+1ML的考嘛斯亮蓝去测浓度。用这种裂解液提蛋白，STAT1做出来了，STAT2没做出来，我觉得您说的是对的，也许就是理解液的原因导致实验失败、

谢谢老师

==============================================================================================================

这也是俺的问题所在，从病人的抗凝血提取PBMC，总是有红细胞，不得不采用裂红啊。很郁闷。听别人说一般分PBMC都会红细胞有，只是多少问题。我也不想用红细胞理解液，呵呵
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发表于 2013-2-2 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这也是俺的问题所在，从病人的抗凝血提取PBMC，总是有红细胞，不得不采用裂红啊。很郁闷。听别人说一般分PBMC都会红细胞有，只是多少问题。我也不想用红细胞理解液，呵呵

==========================================================

还有个问题针对不同蛋白选用不同裂解液，有裂解液选择 方面的资料么？
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发表于 2013-2-2 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有个问题针对不同蛋白选用不同裂解液，有裂解液选择 方面的资料么？

==========================================

不同类型：有细胞、组织、细菌、酵母等
蛋白不同定位：胞膜蛋白、胞浆、胞核、线粒体等
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发表于 2013-2-2 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有个问题针对不同蛋白选用不同裂解液，有裂解液选择 方面的资料么？

===================

具体资料上网搜索
也可以问问我
大部分我还是比较了解
且实用过的
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发表于 2013-2-2 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
阳萎
老师，我还想打扰一下，我的这个胶的配方没问题吧，ACR/BIS和tris-hcl的比例对吗？你能简单帮我看看吗？谢谢。8%的胶 ，分离胶配方(8ml)：H2O 2.635ml 30% ACR-BIS 2.16ml 1M Tris-hcl(PH 8.8) 3.04ml 10% SDS 0.08ml 10% APS 0.08ML TEMED 0.005ml
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发表于 2013-2-2 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dog002 于 2013-2-2 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
阳萎
老师，我还想打扰一下，我的这个胶的配方没问题吧，ACR/BIS和tris-hcl的比例对吗？你能简单帮我看看吗？谢谢。8%的胶 ，分离胶配方(8ml)：H2O 2.635ml 30% ACR-BIS 2.16ml 1M Tris-hcl(PH 8.8) 3.04ml 10% SDS 0.08 ...


没问题
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发表于 2013-2-2 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是膜蛋白，现在我ECL做不出来，但是DAB可以，
1.二抗洗完膜后配制ECL发光液，在暗室没有荧光出现或有一些背景光，但是没有看到条带出现。
2.回到实验室重新洗膜，再加二抗，孵育1个小时（同前），用DAB 显色，不到5秒立刻出现明显的条带。
3.开始怀疑是ECL失效。取适量的AB液混匀，加一微升二抗，在暗室立刻可以看见的荧光，发光液变成棕黄色
4.开始也怀疑蛋白表达量很低，所以现在逐渐加到150微克，可是现在也没有看到荧光或者有微弱的背景光。
5.一抗是1:100或者1：200（推荐1：100-1：400），二抗1：2500（推荐1：2500-1：6000）稀释
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 小中大


QUOTE:
原帖由 ROSE李 于 2013-2-2 09:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的是膜蛋白，现在我ECL做不出来，但是DAB可以，
1.二抗洗完膜后配制ECL发光液，在暗室没有荧光出现或有一些背景光，但是没有看到条带出现。
2.回到实验室重新洗膜，再加二抗，孵育1个小时（同前），用DAB 显色，不到5秒立刻出现明显的 ...

用ECL的时候把二抗调整至1：5000你再试试
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