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标题:【讨论帖】western blot问题解答

tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-2-2 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
心肌梗死

====================================

目的蛋白分子量多少？
呵呵
VEGF不好做
它是一种分泌到细胞外的蛋白吧
你看见的隐约2个条带也不一定是阳性条带

========================================================================================================

您好 VEGF的分子量是29KD 在胞浆中表达 我上次看见的那两个隐约的条带是在26KD和35KD之间 所以我觉得可能是目的蛋白 我也不确定 我的条件是湿转300mA 40min 呵呵 想问问前辈做29KD左右分子量的蛋白湿转用什么条件 我想用您的经验条件再试试 谢谢
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发表于 2013-2-2 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
心肌梗死

=============================================================================================================

您好 VEGF的分子量是29KD 在胞浆中表达 我上次看见的那两个隐约的条带是在26KD和35KD之间 所以我觉得可能是目的蛋白 我也不确定 我的条件是湿转300mA 40min 呵呵 想问问前辈做29KD左右分子量的蛋白湿转用什么条件 我想用您的经验条件再试试 谢谢

===============

300mA 30min
注意降温
祝你好运
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发表于 2013-2-2 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
骨关节炎

=======================================

不同类型：有细胞、组织、细菌、酵母等
蛋白不同定位：胞膜蛋白、胞浆、胞核、线粒体等

=============================================================================================================

我是直接购买的蛋白裂解液，不是自己配的，请问下一般买的蛋白裂解液包含括蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂么？其实我处理细胞就是裂解液+DTT+LOADING BUFFER

明天准备继续做，采用您的常温下牛奶封闭半小时的策略！
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发表于 2013-2-2 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是直接购买的蛋白裂解液，不是自己配的，请问下一般买的蛋白裂解液包含括蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂么？其实我处理细胞就是裂解液+DTT+LOADING BUFFER

明天准备继续做，采用您的常温下牛奶封闭半小时的策略！

=============================================

做磷酸化的蛋白需要加：蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂
普通蛋白需要加：蛋白酶抑制剂
蛋白裂解液里是不包括这些抑制剂的
需要自己另行购买
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发表于 2013-2-2 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助120KD分子的转膜条件，我用的是BIO-RAD的半干转膜仪，做过的条件是15V、2h,结果不理想，请问一下高手这个条件可以吗？
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发表于 2013-2-2 14:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 windy+++ 于 2013-2-2 11:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

求助120KD分子的转膜条件，我用的是BIO-RAD的半干转膜仪，做过的条件是15V、2h,结果不理想，请问一下高手这个条件可以吗？

300mA 2h
转膜过程中注意降温
good luck
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发表于 2013-2-2 14:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问抗体洗脱液的配方?我今天显影没显出,后用丽春红染色膜上有蛋白,有人说用抗体洗脱液洗脱然后从头加一抗,请问是这样的吗?洗脱液洗脱时间是多少?谢谢
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-2-2 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问38KD和185kd蛋白的转膜条件，我用的是湿转，恒流，400mA,需要多长时间？谢谢
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发表于 2013-2-2 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做磷酸化的蛋白需要加：蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂
普通蛋白需要加：蛋白酶抑制剂
蛋白裂解液里是不包括这些抑制剂的
需要自己另行购买

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谢谢老师的回复。
今天又查了些资料，有个说道分离胶和浓缩胶高度问题，也可能会导致你需要的大分子蛋白跑不出来，也就是说分离胶矮了不行。老师一般做的时候浓缩胶分离胶高度是个什么比例呢？
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-2-2 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢你的耐心回复

蛋白条带考染有清楚条带，不知道为什么爆光后的目的条带有三条，请问这是出现了什么问题？对你的回复不胜感激！
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