蛋白质与蛋白组学

请教老师！我的目的蛋白18KD，二聚体30KD，跑了很多次都没有目的条带，10分钟时没有条带，30分钟以上则像考染一样都是杂带，内参压出来还可以。
条件：
分离胶12％，上样量40ug，1.5mm厚胶，100V电泳90分钟，250mA湿转2小时，考染见清楚条带，转膜后胶考染未见条带，未作丽春红染色。一抗，SANTA，1：200，二抗：1：5000。5％脱脂奶粉封闭1小时，一抗室温2小时，TBST洗2分钟，10分钟，10分钟，5分钟，5分钟，5分钟，二抗1小时，洗膜同上。ECL反应3分钟。

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用15%分离胶
转膜1h

补充一下：0.22和0.45的PVDF膜都试过。

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要用0.22um的膜
0.22um膜有个缺点就是背景会比0.45um的要高

想向楼主请教如何简单快捷的得知蛋白是否降解？如果同时用丽染膜和考染胶没有目的蛋白所在位置的蛋白，是否可以结论降解了呢？有什么办法分辨是抗体不灵还是蛋白降解呢？非常感谢！

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我做过AMPK的蛋白
第一次做条带单一，非常好
-20度冻存的样品冻融了两次做WB AMPK就成两条带了
这是一个最简单的实例了
没有具体的检测方法
如果是纯化的蛋白可以通过电泳来比较有没有降解
一般的样品用考染可以看出来有没有降解
但不是很精确的

相关疾病：
心肌梗死

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楼主，你好。我是新手，刚做了几次WB。有几个问题希望解答：
1.湿转过程中电转液的甲醛有什么作用？可不可以用SDS替代？
2.我的目的蛋白是63KD，等电点为8.8，请问用什么电转条件（电流，时间）比较合适？
3.电转条件包括电转成分与蛋白的等电点有无关系？
期待您的解答，谢谢

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1，甲醛？是甲醇吧？
2，63K用 300mA 恒流（半干） 1h20min
1.2mA每平方厘米膜面积 1h30min

楼主，你好。我是新手，刚做了几次WB。有几个问题希望解答：
1.湿转过程中电转液的甲醛有什么作用？可不可以用SDS替代？
2.我的目的蛋白是63KD，等电点为8.8，请问用什么电转条件（电流，时间）比较合适？
3.电转条件包括电转成分与蛋白的等电点有无关系？
期待您的解答，谢谢

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我没有看到过电转语蛋白等电点的资料
不好意思

请问老师，湿转是这个条件，那半干转呢？

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分子量大的半干转肯定不行
不建议采用
大于150K的蛋白我不会用半干转

1，不好意思，写错了，是甲醇，请问它的作用什么？解离与蛋白结合的SDS吗？可是我看有的资料显示有些电转液中还同时加有SDS和甲醇？
2，“1.2mA每平方厘米膜面积 1h30min” 指的是湿转电泳条件吗？
3，我用的是PVDF膜，用之前没有用甲醇浸泡，而是直接用电转液浸泡15min，有影响吗？是不是甲醇浸泡效果更好些？
4，我的实验目的是想从植物总蛋白中杂出我的目的蛋白。想请教下，有无办法可以知道自己目的蛋白表达量究竟有多高？（该基因RNA表达水平是比较高的，可是每次都杂不到带，怀疑是不是蛋白表达水平较低）
谢谢解答。

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1，甲醇起固定作用
2，SDS促进大分子蛋白转移
3，“1.2mA每平方厘米膜面积 1h30min” 指的是半干转电泳条件
4，PVDF用之前必须用无水甲醇活化，不可以直接用电转液浸泡
5，那你就要查你专业的相关文献了，看蛋白表达量的情况