蛋白质与蛋白组学

请问：
我的目的蛋白是beta-catenin 86kDa, 内参的是lamin b1 16kDa.我用0.45 的pvdf 膜可以吗？

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还是用0.22um的膜吧

请问26KD蛋白和45KD的β——actin可以在同一块胶上作么？选用什么样的？10%还是15%的胶？

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用12%
可以

做了几次WB，一抗用过单抗，1：200孵育3h，1：500过夜，也用过多抗，1：500过夜，二抗1：5000孵育2h，阴性对照的也出现条带，跟目的条带似乎一样的位置，强度也差不多，不知道原因，谢

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呵呵
很正常啊
一抗浓度调小试试

请教，做了几次WB，一抗用过单抗，1：200孵育3h，1：500过夜，也用过多抗，1：500过夜，二抗1：5000孵育2h，阴性对照的也出现条带，跟目的条带似乎一样的位置，强度也差不多，不知道原因，谢

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呵呵
很正常啊
一抗浓度调小试试

试过一抗浓度调小，不过阳性对照的目的条带也变得很弱。。。

请教，做了几次WB，一抗用过单抗，1：200孵育3h，1：500过夜，也用过多抗，1：500过夜，二抗1：5000孵育2h，阴性对照的也出现条带，跟目的条带似乎一样的位置，强度也差不多，不知道原因，谢

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呵呵
很正常啊
一抗浓度调小试试

试过一抗浓度调小，不过阳性对照的目的条带也变得很弱。。。

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换阴性对照试试啊
你现在用的阴性对照可靠不

用12%
可以

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谢谢老师，今天下午110KD蛋白的转膜让人很郁闷，参照您的300MA 2小时 ， 结果膜花了，象树枝样的花纹布满了膜，不知道怎么回事，以前还从没碰到这种情况，估计 是今天用了上次用过的转膜缓冲液造成的，缓冲液只用过一次。 以前基本是新配

今天做不成了，明天准备跑2块胶 一块8%一块12% 。一块跑110和90，另一块跑43和26KD的。但是有个问题，这2块胶目的条带跑胶的时间可能会有所不同，转膜时间也会不同，如果想一起做，有什么好的办法不？

还2个小问题就是转膜和电泳缓冲液反复使用问题，想听听老师的意见，一般能用几次？用后怎么保存以便下次再用？我现在一般每次都是新配 ！

蛋白上样量少了会不会和大分子跑不出来有关系？我一般上量30-50

如老师在，谢谢老师回复哈，准备倒胶了，如果您认为我明天跑2块胶不合适，我今天就倒一块胶，明天早上来跑

1，300mA转膜，要降温！
2，缓冲液肯定不能重复使用了！
3，把胶剪好，转不同的时间
4，电泳缓冲液内槽肯定不能重复，外槽可以
5，转环是坚决不能重复使用的：甲醇蒸发；蛋白转移后有一部分会在缓冲液里
6，大分子量蛋白占总蛋白的量是比较小的，先染胶看条带。但是110K的很好做
7，可以一起跑，因为不同的胶浓度在分离时的速度基本差不多
祝你好运

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谢谢老师，我估计还是缓冲液的问题，我每次都降温了，用的冰，今天第一次碰到这种情况

您的意思是我跑两块胶，电泳时间还是一样，但是转膜时，一起转，到时候先把转时间短的膜拿出来，再继续转时间长的那块膜么？

另外转缓每次都要用甲醇200ML，呵呵，做的多用量还是很大啊。但我还是听您的，每次转缓和电泳都新配算了

进口抗体已经回来了，但是说明书都说要求一抗4C 过夜，但也有人说37C一小时也行，甚至不摇，直接放在37C 温箱中，呵呵。我一般都是用BSA稀释后过夜的。

今天失败的膜照片已经发至您邮箱，麻烦您有时间看看，谢谢

谢谢老师，我估计还是缓冲液的问题，我每次都降温了，用的冰以前还用350MA跑过的，今天第一次碰到这种情况

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您的意思是我跑两块胶，电泳时间还是一样，但是转膜时，一起转，到时候先把转时间短的膜拿出来，再继续转时间长的那块膜么？

另外转缓每次都要用甲醇200ML，呵呵，做的多用量还是很大啊。但我还是听您的，每次转缓和电泳都新配算了

进口抗体已经回来了，但是说明书都说要求一抗4C 过夜，但也有人说37C一小时也行，甚至不摇，直接放在37C 温箱中，呵呵。我一般都是用BSA稀释后过夜的。

今天失败的膜照片已经发至您邮箱，麻烦您有时间看看，谢谢