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标题:【讨论帖】western blot问题解答

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-2-5 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问老师，1、用考马斯亮蓝染过的胶可不可以再转膜?
2、转膜时什么也转不上（膜上什么也没有）是怎么回事？
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-2-5 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同一块胶不行

=============================================================================================================

多谢老师的提醒，您是不是认为我应该83,91跑10%的胶，113的跑8%的胶，而不能在同一浓度的胶跑？您上次好像教我的是这3个蛋白都可以用10%的胶跑哦？

还有一抗回收的问题，老师能给点建议么？回收了怎么保存，回收的抗体能用几次？还是每次最好配新的？
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发表于 2013-2-5 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问老师，1、用考马斯亮蓝染过的胶可不可以再转膜?
2、转膜时什么也转不上（膜上什么也没有）是怎么回事？

==================

不可以
蛋白已经被固定了
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发表于 2013-2-5 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢老师的提醒，您是不是认为我应该83,91跑10%的胶，113的跑8%的胶，而不能在同一浓度的胶跑？您上次好像教我的是这3个蛋白都可以用10%的胶跑哦？

还有一抗回收的问题，老师能给点建议么？回收了怎么保存，回收的抗体能用几次？还是每次最好配新的？

=====================================

当然可以用10%的胶了
只是这两个你要同时做的话分子量离得太近了
我不回收使用一抗
如果回收了在近期使用吧
放置4度
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发表于 2013-2-5 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
大动脉炎

=====================================

当然可以用10%的胶了
只是这两个你要同时做的话分子量离得太近了
我不回收使用一抗
如果回收了在近期使用吧
放置4度

=============================================================================================================

老师，如果我把MARK点在中间，转膜后从中间剪开，一块膜做STAT1(83,91)stat1本来就是2条带，一个84,一个91，另一块做STAT2(113)行么?
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发表于 2013-2-5 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，如果我把MARK点在中间，转膜后从中间剪开，一块膜做STAT1(83,91)stat1本来就是2条带，一个84,一个91，另一块做STAT2(113)行么?

===============================

可以
但是Marker的上样体积与样品最好一致
你一共几个样品？
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发表于 2013-2-5 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
骨关节炎
五个抗体，一个患者的PBMC提取蛋白同时做五个抗体。但是我担心从PBMC提的蛋白不够用。因为我一般的裂解液体系是120UL。一次上个20，就没了。而且您说的和MARK上样量一致，那MARK可用得多啊，呵呵，我一般加5UL MARK的，但是样本我一般加15-20

而且肯定会有很多空白的孔需要加LOADING BUFFER来平衡电压

我想5个抗体两块胶搞定。
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发表于 2013-2-5 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zwsyrt 于 2013-2-5 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
骨关节炎
五个抗体，一个患者的PBMC提取蛋白同时做五个抗体。但是我担心从PBMC提的蛋白不够用。因为我一般的裂解液体系是120UL。一次上个20，就没了。而且您说的和MARK上样量一致，那MARK可用得多啊，呵呵，我一般加5 ...

这样的话Marker放在中间不合适
会使两侧的泳道变形
你斟酌下吧
可以这样上buffer、PBMC、PBMC、PBMC、buffer、Marker、PBMC、PBMC、PBMC、buffer
但是做之前我还是建议你用正常人或者量较多的样品来做预实验
别一次样品全废了
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-2-5 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-2-5 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


这样的话Marker放在中间不合适
会使两侧的泳道变形
你斟酌下吧
可以这样上buffer、PBMC、PBMC、PBMC、buffer、Marker、PBMC、PBMC、PBMC、buffer
但是做之前我还是建议你用正常人或者量较多的样品来做预实验
别一 ...

谢谢老师。如果保险些，您认为这五个蛋白26,43,84,91,113应该怎么分胶来做，空白孔BUFFER的加法有什么技巧么！？就是您说得泳道变形是BUFFER加法不对造成的么？以前没注意过这类问题。o(∩_∩)o.
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 小中大
请教老师，转模时直接用电极液作为转膜缓冲液好不好？
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