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标题:【讨论帖】western blot问题解答

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-2-5 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
大动脉炎

==================================

1，过夜保存分离胶，浓缩胶建议用前再配
2，如果是这样的膜，我是不会用的

==============================================================================================================

老师，我打错了，是跑的胶边缘是卷的。转膜时放在滤纸上不平

今天STAT2还是没做出来，明天再做最后一次，加大上样量，一般我上样30-40左右，明天再多加点，还做不出来就找找其他原因吧，实验条件我基本应该没问题了。
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发表于 2013-2-5 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
大动脉炎

=====================================

1，过夜保存分离胶，浓缩胶建议用前再配
2，如果是这样的膜，我是不会用的

==============================================================================================================

老师，我打错了，是跑的胶边缘是卷的。转膜时放在滤纸上不平

今天STAT2还是没做出来，明天再做最后一次，加大上样量，一般我上样30-40左右，明天再多加点，还做不出来就找找其他原因吧，实验条件我基本应该没问题了。
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发表于 2013-2-5 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师：您好！
最近试验遇到问题，我要疯了快，我以前作western很好，但是最近突然出现一种现象就是加上ECL发光液之后整张膜都发光，后来我选择使用封闭液来稀释抗体，好了一段时间，但是目的条带也弱了，可是不知道为什么后来又反复出现这种情况，我已经将所有试剂都重新配置了，您觉得可能是抗体的问题吗，可是为什么我降低抗体的浓度，一点好转的迹象都没有呢，非常感谢老师谢谢！
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2013-2-5 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教老师：转膜缓冲液用什么配方最好？
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发表于 2013-2-5 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师：您好！
最近试验遇到问题，我要疯了快，我以前作western很好，但是最近突然出现一种现象就是加上ECL发光液之后整张膜都发光，后来我选择使用封闭液来稀释抗体，好了一段时间，但是目的条带也弱了，可是不知道为什么后来又反复出现这种情况，我已经将所有试剂都重新配置了，您觉得可能是抗体的问题吗，可是为什么我降低抗体的浓度，一点好转的迹象都没有呢，非常感谢老师谢谢！

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ECL换了吗？
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发表于 2013-2-5 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教老师：转膜缓冲液用什么配方最好？

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湿转还是半干？
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发表于 2013-2-5 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
湿转还是半干？

===================

老师，我用的是半干式
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发表于 2013-2-5 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2013-2-5 11:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
湿转还是半干？

===================

老师，我用的是半干式

39mM glycine
48mM Tris
0.0375% SDS
20% methanol

1.2mA每平方厘米膜面积
恒流
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-2-5 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再请教NBA老师一个问题：预染marker好用么？我以前没用过。我现在用的预染marker是14-170的，胶跑出来以后就很明显的分成10条蓝色条带，请问，转膜的时候这些蓝色条带转到膜就能证明蛋白转到膜上了么？
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-2-5 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
骨关节炎

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最近倒胶不顺，长期分离胶凝了不平，不知道怎么回事，桌面应该是平的，胶面总是往2边下降。
另外老师给的建议
1，26，43用12%胶
2，84，91，113用10%胶
这2块胶上的样本，MARK，LOADING BUFFER的排列应该是怎么样的？ 估计 会有很多孔空着，毕竟只5个样本

今天做了小分子的蛋白，一个26的一个43的，曝光很不顺利。我用的皮尔斯的ECL，一般加了后，就用膜包好放在卡盒中了，至于曝光时间一般是1-5分钟。加了ECL没亮带，曝光什么都没有，上次也这样，但是DAB显色却可以看到26的目的蛋白，不知道是怎么回事？曝光的操作有什么不对的地方么？
没亮带是不是应该加大二抗稀释度，一抗需要变化么？而且今天我用得进口抗体，直接用BSA稀释的，没有按照他的加TBST，呵呵。幸好是预试验
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