蛋白质与蛋白组学

我今天做wb，转膜没问题，最后显影的时候，可能没加2号液，也可能加了，溜号了，30分钟曝光后片子上就可以见到浅浅的带，不仔细看就什么都没有（一点东西都没有，背景都没有），请问1）如果只加1号液，能显影么，2）如果不是忘记加2号液了，还会是什么原因，最近换奶粉了，不过也是脱脂的，新打开的3）如果是忘了加2号液，怎么重复使用膜呢，是stripping还是wash就可以了
不好意思问题有点多，谢谢
补充一下，2个月前做的同样的wb都有很好的结果，是什么问题呢

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1，你说的1、2号液是不是ECL的A、B液啊？抑或是稳定剂与发光剂，名称不同
2，有条件使用BSA
3，直接Wash后重新加ECL孵育，没问题的
4，两个月前与现在的不能做确切的比较，只能做参考，抗体活性会下降，样品会讲解
你用的条件也会有一些不一样（如试剂等或者ECL换了灯）祝你实验顺利

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buffer处上一倍的loading??老师？不太懂

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呵呵
别叫老师，
听着怪怪的
一倍的loading的意思就是：你在你的样品是不是要用2倍或者5倍的样品缓冲液啊，把它用你稀释样品的缓冲液稀释样品缓冲液至一倍，在空泳道上等体积的buffer
好像挺拗口
慢慢看

你的2倍loading里不含溴酚蓝？
稀释成1倍上样
因为你的样品中loading的含量就是一倍的

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我处理样本是48裂解液 12DTT 60 2XLODING BUFFER,总体积120.加另外13UL的溴芬兰。BUFFER里没溴芬兰。
您认为怎么加啊？我加错了？

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定 恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

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可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～

你的2倍loading里不含溴酚蓝？
稀释成1倍上样
因为你的样品中loading的含量就是一倍的

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继续问，刚刚孕育一抗过夜回来了。
今天按您的步骤同时做2块膜，转膜一小时后先拿出一块膜，本想等另一块转好拿出来一起洗和封闭，但是不知道该怎么保存，所以先洗了一块膜封闭，等另一块膜好了再拿出来洗封闭，这就引出个问题，应该怎么保存第一块膜，让他和第二块一起开始做呢？

同时曝光的膜以后想再继续曝光？是不是应该先洗几次，4度保存啊？用塑料袋？

我处理样本是48裂解液 12DTT 60 2XLODING BUFFER,总体积120.加另外13UL的溴芬兰。BUFFER里没溴芬兰。
您认为怎么加啊？我加错了？

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呵呵
是有问题