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标题:【讨论帖】western blot问题解答

dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2013-2-5 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近一直在做western blot
想我用的内参是HRP-GAPDH，如果我只想显色内参，是不是封闭后，加入GAPDH，就可以了？
如果接下来要显色目的蛋白，需不需要用一抗二抗洗脱液洗脱？
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发表于 2013-2-5 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近一直在做western blot
想我用的内参是HRP-GAPDH，如果我只想显色内参，是不是封闭后，加入GAPDH，就可以了？
如果接下来要显色目的蛋白，需不需要用一抗二抗洗脱液洗脱？

=====================================

是封闭后直接加入GAPDH-HRP，孵育后显色

为什么先做GAPDH？
应该先做目的蛋白
洗脱的话会损失蛋白
做半定量的话不建议洗脱做
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发表于 2013-2-5 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
心肌梗死
f我已经重复快2周了，目的还是没出来，直接上图：
目的蛋白：72KD的膜蛋白，8%分离胶，用的是碧云天的SDS-PAGE试剂盒配制，电泳80V，然后120V，共75min；湿转350mA，90min，5%脱脂奶粉（PBST配制）封闭4h，一抗（1：1000) ,4°c过夜；PBST 洗3次*10min；二抗（1：3000）2h，3次*5min；DAB显色。结果如图，很纳闷。先谢谢老师的指点。


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2013-2-5 16:16
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发表于 2013-2-5 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 TAT 于 2013-2-5 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
心肌梗死
f我已经重复快2周了，目的还是没出来，直接上图：
目的蛋白：72KD的膜蛋白，8%分离胶，用的是碧云天的SDS-PAGE试剂盒配制，电泳80V，然后120V，共75min；湿转350mA，90min，5%脱脂奶粉（PBST配制）封闭4h，一抗（1：1000) ,4°c过夜；P ...

呵呵
别郁闷
实验不顺利很正常
这几天我也不太顺利
共同努力
你的条件基本没有问题
我认为：1，膜蛋白没有提取出来
2，你的DAB染色方法敏感度较低，建议改用ECL
保持联系
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发表于 2013-2-5 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

向楼主请教一下，我这几天转膜后发现在Make的左边总出现其copy一样的条带，不知什么原因，希望您帮分析一下，多谢！我的Marker上样5ul，之前没有出现过。
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发表于 2013-2-5 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前一段时间做Western已经比较熟练了，条带也跑的很漂亮，但是这几天两次实验到最后发光的时候片子上竟然什么也没有，特别的干净。所有缓冲液都是新配的，转膜后MARKER也很清晰，凝胶考马斯亮蓝染色后也有条带，今天试了一下二抗和发光剂也没有问题，但是暗室曝光时膜上加发光剂后没有荧光，连着做了三种蛋白都没有结果，和我之前做的步骤我也没想出来有什么不同。
今天还做了ACTIN，几乎什么液体都是新配的，还是不行，您说到底怎么了啊？
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发表于 2013-2-5 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
向楼主请教一下，我这几天转膜后发现在Make的左边总出现其copy一样的条带，不知什么原因，希望您帮分析一下，多谢！我的Marker上样5ul，之前没有出现过。

===============================

换Marker了？
另外曝光的时候是不是把胶片动了？
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发表于 2013-2-5 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前一段时间做Western已经比较熟练了，条带也跑的很漂亮，但是这几天两次实验到最后发光的时候片子上竟然什么也没有，特别的干净。所有缓冲液都是新配的，转膜后MARKER也很清晰，凝胶考马斯亮蓝染色后也有条带，今天试了一下二抗和发光剂也没有问题，但是暗室曝光时膜上加发光剂后没有荧光，连着做了三种蛋白都没有结果，和我之前做的步骤我也没想出来有什么不同。
今天还做了ACTIN，几乎什么液体都是新配的，还是不行，您说到底怎么了啊？

======================

测一下缓冲液的pH
另外一抗是不是过期了
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发表于 2013-2-5 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，这几天做32KD的蛋白杂交，第一天做出了很好的带挺亮的，可是到第二天的时候做出来的，带是有的，不过很不清楚几乎看不出啦，转膜的时候mark都转上去了，我想问题应该是出在杂交上，但是我有不知道具体处在那里啊？我的PVDF膜 ，用的ECL显色液，请高手指点一下啊
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发表于 2013-2-5 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教前辈，我准备做淋巴细胞磷酸化蛋白的WB，我可不可以想冻存组织那样先把细胞冻起来，准备做的时候再拿出来提蛋白，还是应该把蛋白提取出来以后再冻呢，还有你说做磷酸化的蛋白，应该将抗体用BSA稀释，这是为什么呢？谢谢
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