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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-8 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，您好！
我最近做western遇到一些问题向您请教下。抗体是cell signal的，第一次做的时候一抗按照1：2000稀释，二抗1：2000稀释，蛋白上样量15ug，没有杂出任何条带，考虑可能一抗浓度不够，第二次把一抗的浓度调整为1：1000，蛋白上样量30ug，因为是连续做的，所以接着用了前面的抗体，把浓度调整了一下，还是什么都没有杂出来，第三次考虑二抗的浓度过高消耗了ECL底物，把二抗浓度调整为1：4000，上样量40ug，还是什么都没出现，此外第二次actin出现了一次，第三次actin用的半个月以前配的杂出来了，新近配的没杂出来，请问楼主是什么原因呢？

===========================================================================

1，第三次actin用的半个月以前配的杂出来了，新近配的没杂出来，你说的新近配的是什么意思
2，目的蛋白是什么？
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发表于 2013-2-8 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主好：我做130kd的蛋白，8%的胶。转膜液体10%甲醇，千分之一SDS。300ma 1个半小时。转膜完成后发现marker在膜上不明显 无法切膜。奇怪的是比较小的marker都能看到，反而是70多的红色marker非常模糊.请您分析一下是什么原因。

================================

这样的情况要看看你的marker如何了
丽春红染过转移后的膜吗？
用丽春红染膜来验证一下转移效果
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831226[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好 我最近在做WESTERN 出现个问题，就是当切割完胶后放入转印槽中打开电泳仪没有电流 不知道出现什么问题 检测后发现不是电线的问题 也是不电泳仪的问题，但是弄不懂为什么没有电流那？ 就是没接通的状态。
敬等回答，谢谢了！~
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发表于 2013-2-8 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 831226 于 2013-2-8 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好 我最近在做WESTERN 出现个问题，就是当切割完胶后放入转印槽中打开电泳仪没有电流 不知道出现什么问题 检测后发现不是电线的问题 也是不电泳仪的问题，但是弄不懂为什么没有电流那？ 就是没接通的状态。
敬等回答，谢谢 ...

半干还是湿转？
如果是半干的话有可能是滤纸、膜、胶、滤纸短路了
要是湿转的话不存在短路问题
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standbyme[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教！WB的结果条带用软件进行统计后出现两个数值：总密度与平均密度。
请问目的条带要与内参条带进行比对时应该用哪个数值比较准确？貌似有不少人用的是平均密度的比值去比较，但我觉得总密度才能很好衡量反映总量，而且肉眼看总密度似乎得出的结果更准些？我的结果是用总密度比较有差别而平均密度没有差别。
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发表于 2013-2-8 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 standbyme 于 2013-2-8 09:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教！WB的结果条带用软件进行统计后出现两个数值：总密度与平均密度。
请问目的条带要与内参条带进行比对时应该用哪个数值比较准确？貌似有不少人用的是平均密度的比值去比较，但我觉得总密度才能很好衡量反映总量，而且肉眼 ...


个人感觉现在用的多的是积分光密度值（IOD）
用目的条带的IOD比上相应内参的IOD
IOD是总的密度
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发表于 2013-2-8 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品冻融了几次？
感觉是样品冻融

=================================================

样本用了2个月，做的次数也不超过10次
是冻融次数多会使样本蛋白降解吗？可为什么内参可以出来呢
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发表于 2013-2-8 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2013-2-8 09:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
样品冻融了几次？
感觉是样品冻融

=================================================

样本用了2个月，做的次数也不超过10次
是冻融次数多会使样本蛋白降解吗？可为什么内参可以出来呢 ...

内参当然能出来了
我做过37度水浴实验
样品用37度水浴融化、-20度冻起来、37度水浴融化.....
这样做10次内参条带有些减弱，但是还能做出来
内参是比较稳定的蛋白、含量较多，冻融后条带会一次比一次弱的
目的蛋白就不一样了
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发表于 2013-2-8 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我目的蛋白大概40kD，内参为B-Tubulin 55kD，想在一张膜上把这两个蛋白抗体都结合上去，请问：我是应该先孵育一种抗体，洗涤，再孵育另一种抗体，洗涤，上二抗；还是把两种蛋白抗体混合在一起孵育，洗涤，再上二抗？两种抗体之间会不会互相影响？谢谢！
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教版主：

我现在正在做一个非磷酸化蛋白的Wb，蛋白分子量是80KD，这个蛋白有磷酸化和非磷酸化两种状态，非磷酸化状态时在胞核，磷酸化时在胞浆，之前提的冰冻组织的总蛋白，裂解液用的是碧云天的，上样量加到了150微克，一抗稀释浓度为1比100都没怎么做出来，请问我这种情况需要提取核蛋白做吗？

有没有一些好的建议，提示一二，感激不尽啊
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