蛋白质与蛋白组学

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我的组织蛋白提取后浓度较大，而western电泳的上样量有限制，所以我的样品上样体积要很小，我想把样品稀释下，那样量取样品样好操作些，请问有什么方法呢。看到有的说可以用裂解液稀释，那这个裂解液可不可以是不加PMSF的啊。 或者有没有其他的方法可以解决这个问题啊。谢谢

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[size=2]稀释样品的时候一般用裂解液或者PBS，加入样品缓冲液后变性，变性后蛋白降解就会慢很多
PMSF是一种光谱的抑制剂，在蛋白提取中要加，很重要
祝你实验顺利

1，做PARP这个蛋白可能会效果比较差，另两个应该问题不大
2，你用湿转还是半干转？

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恩，我用的是湿转。PARP的问题怎么解决呢？是换一种裂解液吗？谢谢

1，Zymed的二抗我用过，很好用，用ECL发光的时候它的稀释度是1：10000
2，一抗、二抗的浓度要合适才好，建议你看《抗体技术指南》一书

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恩，好的，谢谢fangweibin119师兄，我重新稀释一下抗体再试试！

1，我是加满了之后上样的，在你的sample buffer中有甘油，样品会很快沉底的
2，控制在4度我没有好办法
3，4度离心我一般是15到20min
4，细胞蛋白浓度一般就是你说的这个样子，当然行了

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谢谢老师了，几天没看到还以为您出外云游了，呵呵
今天看了个操作指南，胶聚合后加了电泳缓冲液再拔梳子。而我一般是把梳子拔了再卡在玻璃板中加缓冲液，那种方法更好。

直接用预冷的PBS洗3遍细胞
洗完后把PBS弃去就可以加裂解液了，按照说明书操作
不知道你用的是哪家的膜蛋白提取试剂

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老师我以前试过用冷的PBS洗细胞有脱落的现象，查资料好像有这种可能性。
所以现在我一般是把PBS拿出来放一下再洗六孔板的细胞。
如果用冷的PBS洗细胞脱落了，是不是说明细胞本身状态就不好啊？