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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-8 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
梯度胶，我这里没有梯度仪，所以配制不了。
只能用浓度小的分离胶，内参是66kd的，那么分子量分别为359kd和66kd,要用多大浓度的胶，您给个建议！

===================================================

想保留内参很难
你的分离胶高度是多少？
如果分离胶高度能达到10cm就可以用8%的胶来做
400K的我做过
用的电泳槽型号是DXCZ-24E，你可以上网搜一下它的具体信息
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发表于 2013-2-8 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，是在转膜之前泡甲醇之间就用铅笔么？

============================

直接用铅笔标好了再浸泡甲醇活化
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发表于 2013-2-8 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，首先谢谢你的解答。按你的意思来说，我做组织的western可信不高，想请教一下，组织蛋白上样量的问题，上多少量的蛋白可以？

====================================

摸条件的时候第一次我一般上40ug
按照预实验结果来决定正式实验时的上样量
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mysmdbl[使用道具]
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发表于 2013-2-8 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主您好，我需要检测处理后syk磷酸化程度的改变(即目的为p-syk），请问我的内参应该是选择syk,还是选择erk1/2，或是actin?
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发表于 2013-2-8 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mysmdbl 于 2013-2-8 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

版主您好，我需要检测处理后syk磷酸化程度的改变(即目的为p-syk），请问我的内参应该是选择syk,还是选择erk1/2，或是actin?

我个人认为要选择syk作为磷酸化程度的对照
同时选择actin作为syk与p-syk上样量的参照
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-2-8 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大哥好，请你一定要帮我分析我的问题：
溴芬蓝条带在浓缩胶不压成一条很窄的带，大约有“二”这个字宽，以前84V要30分钟，现在只要20分钟，
其他条件不变，
ECL结果：出现多条带，而且条带明显比以前细，
请问这大概是什么原因啊？感谢！
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发表于 2013-2-8 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想保留内参很难
你的分离胶高度是多少？
如果分离胶高度能达到10cm就可以用8%的胶来做
400K的我做过
用的电泳槽型号是DXCZ-24E，你可以上网搜一下它的具体信息

=============================================================================================

您说的DXCZ-24E我没有查到，科里也不能买仪器。3%浓缩胶，6%的分离胶可以吗？内参我从跑一张胶，这样可以吗？
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-2-8 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在做问题western blot 时遇到难以想通的问题，希望高手解答：
目的蛋白的分子量在44KD 可是每次做下来条带到靠近于55KD的地方 没有杂带 是什么原因？

另外一个目的蛋白在100KD 可是每次做下来 在130KD 和70KD的地方都有很明显的很好看的条带， 只有抗体浓度非常高时，在100KD处才会有淡淡的一条带，而抗体浓度下降时消失，而130，70KD的条带很好看，那么100KD的是我的目的条带吗 还是其他两个有可能是我的目的条带吗？

另外，有一个目的条带，转膜时蛋白染色很好看，可是曝光时条带总是不成形，而相同区域另一个蛋白条带很好看，是抗体的原因吗，这是一个核受体，是提取蛋白时需要特定的措施吗？
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发表于 2013-2-8 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我个人认为要选择syk作为磷酸化程度的对照
同时选择actin作为syk与p-syk上样量的参照

==============================

那我分析的时候应该怎么分析？
是(1)syk/actin;(2)p-syk/syk;然后再？
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Ao7[使用道具]
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发表于 2013-2-8 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我刚开始做WB ，我转膜后有用立春红染色，显示上面有蛋白条带，我想问下这是不是说明转膜已经成功，另外一个问题，我曝光后发现上面什么都没有，我尝试过3min 5min 30min,都没有，我想问下什么原因（我当时膜正反面不太确定，这样会不会有影响呢），请帮我解释下，非常感谢
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