【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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1671

发表于 2013-2-20 17:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，膜蛋白不好提取，有可能没有提出来
2，膜蛋白名称告诉我一下
3，抗体问题

============================================================================================================

您的答复真快呀,谢谢！我的膜蛋白是GABAB受体，二抗稀释度我做过，不同稀释度都没有问题，一抗五月份做的免疫荧光还好着呢。建议的一抗稀释度为1：500~1：1000，我都用到1：200了还没出来。谢谢你，帮我找找看什么原因。

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1672

发表于 2013-2-21 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知您是否做过膜蛋白，您用的哪家的裂解液，如果是自己配的，可否告知配方及提取过程？**。该裂解液只提膜蛋白还是胞浆蛋白、核蛋白都提了？谢谢！

=========================================

膜蛋白当然做过啊
要看什么膜蛋白
我没有用过单独的膜蛋白抽提试剂
另外胞浆、胞核有专门抽提这些组分的试剂盒
提取过程可以告诉你
以后邮箱用短消息的形式发

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1673

发表于 2013-2-21 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您的答复真快呀,谢谢！我的膜蛋白是GABAB受体，二抗稀释度我做过，不同稀释度都没有问题，一抗五月份做的免疫荧光还好着呢。建议的一抗稀释度为1：500~1：1000，我都用到1：200了还没出来。谢谢你，帮我找找看什么原因。

============================

你用哪家的抗体，抗体号是多少？
用什么裂解液？

tuuu2[使用道具]
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1674

发表于 2013-2-21 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用哪家的抗体，抗体号是多少？
用什么裂解液？

==================================================================

一抗是abcam的，抗体号是ab75239，裂解液是***的全蛋白RIPA裂解液。谢谢！

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1675

发表于 2013-2-21 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 tuuu2 于 2013-2-21 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你用哪家的抗体，抗体号是多少？
用什么裂解液？

==================================================================

一抗是abcam的，抗体号是ab75239，裂解液是***的全蛋白RIPA裂解液。谢谢！ ...

前段时间我一师弟做过这个蛋白
抗体可能不一样
全蛋白裂解液应该能提出这个蛋白
还有抗体有多长时间了？

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1676

发表于 2013-2-21 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位前辈们，我想咨询一下,B-action 和GAPDH做内参有什么差别呀？细胞的状态对二者的表达有影响吗？为什么我的两株细胞一株B-action 能做出来，可是GAPDH不出来，另一株GAPDH能做出来，action 又不出来。能不能介绍一种所有细胞都表达的内参呀？？谢谢！！！

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1677

发表于 2013-2-21 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我是做western的新手，现在在做B-actin摸条件，但是几次下来结果都一样，图在后面。具体步骤是：
1、thermo公司的细胞裂解液+pmsf裂解细胞。BCA试剂盒定量蛋白，2×sds上样缓冲液100度变性10min
2、10%的分离胶，100V电泳
3、100v转磨2小时，冰浴
4、5%脱脂奶封闭2小时
5、I抗sigma的单抗1：3000过夜
6、rockland公司的II抗1：1000 2小时，odyssey显色

我想了好多方面的问题，但是maker是好的，说明胶的配置没有问题，转膜也没有问题，刚开始我以为是I抗的问题，从其他人那里讨了一点做过正常的也不行，如果是封闭的不好，但是背景还是蛮干净的，应该不是封闭的问题。
是不是收集蛋白的时候只加PMSF一种蛋白酶抑制剂不行呢，有蛋白降解了？
谢谢！

附件

2013-2-21 15:17

19385268.jpg (12.46 KB)

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1678

发表于 2013-2-21 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也碰到了像楼上“不高兴和没头脑”一样的问题----“几乎整张膜都发光，像盏黑夜里的明灯，指引我走向失败。”
太诡异了，同时做了两个膜，一个膜（目的1和内参1）洗的很漂亮，但是另一个膜（目的2和内参2）就整个很亮，还没有条带。两个膜除了用的一抗不一样外，其他条件都是相同的，更郁闷的是前段时间只是内参2出现这种情况，现在传染的目的2这样了（目的2，内参2不久前用一样的条件都洗出来过呀）。到底是咋回事呀，崩溃了。求老师帮忙解救一下啊。

owanaka[使用道具]
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1679

发表于 2013-2-21 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问版主，IOD值怎样确定上样量？谢谢

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1680

发表于 2013-2-21 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位前辈们，我想咨询一下,B-action 和GAPDH做内参有什么差别呀？细胞的状态对二者的表达有影响吗？为什么我的两株细胞一株B-action 能做出来，可是GAPDH不出来，另一株GAPDH能做出来，action 又不出来。能不能介绍一种所有细胞都表达的内参呀？？谢谢！！！

==============================

beta-actin，GAPDH，beta-tubulin
在细胞内都有稳定表达

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