蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  181/610 |‹‹‹179180181182183184185186187188›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
1801

发表于 2013-2-22 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验进展不好，84，91目的条带有。但内参和25，46的条带无论如何出不来。
标本量有限，增大上样量已不可能，应该怎么办？
用的抗体是CELLSIGNAL的。一抗推荐1：1000不变
二抗1：1000-3000
是哪里出了问题？
能给个解决问题的思路么

==============================

内参都做不出来你还做目的蛋白啊？
先把内参做好
换抗体
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
1802

发表于 2013-2-22 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想问一个问题：
我在转膜的时候如果一个转膜槽中转两块胶的话，那么靠近负极的那板老是转不好，就是像被水冲散了一样，是怎么一回事呢？
请帮忙回答，谢谢。

========================================

我没碰到过这样的问题
如果一块好一块不好，你可以考虑转移槽的问题
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
1803

发表于 2013-2-22 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参都做不出来你还做目的蛋白啊？
先把内参做好
换抗体

================================

说错了，时有时无，内参。不是没有
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1804

发表于 2013-2-22 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说错了，时有时无，内参。不是没有

===============

先做内参
稳定你的系统
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
1805

发表于 2013-2-22 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先做内参
稳定你的系统

======================================================

请问下是不是只要内参出的来，目的条带出不来就是抗体的问题？
或者说只能加大上扬量？怎么才能确定是不是抗体的问题
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1806

发表于 2013-2-22 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问下是不是只要内参出的来，目的条带出不来就是抗体的问题？
或者说只能加大上扬量？怎么才能确定是不是抗体的问题

==============================================================================================================

1，先确定内参说明你在整体的操作上没有问题，以及二抗也没有问题（内参、目的蛋白采用的二抗没有问题，如果目的蛋白与内参采用不同的二抗要确认二抗没有问题）
2，目的蛋白做不出来有以下几点
A：目的蛋白上样量不够
B：目的蛋白没有提取出来（不同蛋白在细胞中的定位不同：如核、膜等）
C：目的蛋白抗体特异性不好
D：检查抗体的cross reaction的物种
E：用阳性对照样品来确定
F：ECL敏感性不够
G：抗体的稀释度有问题
H：抗体买回来之后的保存条件、避免反复冻融及污染
排除这些问题之后基本上就可以确认目的蛋白抗体有问题了
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
1807

发表于 2013-2-22 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
师兄你好，我的蛋白样品出现絮状沉淀，加样时感觉一团一团的，果然电泳的时候出现了明显的拖尾现象。
我是先裂解的蛋白，然后12000离心，我一般离心2次，每次5到10分钟，就是怕离心的不彻底，离心完之后就加入loading buffer变性分装-20度保存。
我的样品才提了3天，所以我觉得应该不会是已经发生变质了，难道使用之前还要进行离心吗，可是我已经分装了，每一管才30ul，请问应该是什么问题，如何解决，谢谢了！

变性后，上样之前短暂离心，取上清电泳
（蛋白浓度多大？）

师兄你好，我照着你的方法做了，这样离心的话会不会把浓度变低了呢，我之前没有测蛋白浓度，所以也不清楚，不过我现在上同样的量的话感觉出来的荧光条带没有以前亮了。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1808

发表于 2013-2-23 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 831226 于 2013-2-22 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
师兄你好，我的蛋白样品出现絮状沉淀，加样时感觉一团一团的，果然电泳的时候出现了明显的拖尾现象。
我是先裂解的蛋白，然后12000离心，我一般离心2次，每次5到10分钟，就是怕离心的不彻底，离心完之后就加入loading buffer变性分装 ...

1，蛋白浓度过高，加入sample buffer进行蛋白变性时容易有沉淀产生（血清进行电泳前如果不调整浓度直接加入sample buffer会有沉淀产生，因为SDS量还没有蛋白多）
2，蛋白浓度应该调整后进行变形
3，蛋白离心的时候有一些杂质被吸出来
顶部
flower-201[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74055
精华 0
积分 443
帖子 605
信誉分 100
可用分 3785
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
1809

发表于 2013-2-23 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师：
我买的ABCOM的GABAAR α1 抗体，做大鼠脑组织（大脑皮层、海马、小脑），大鼠用农药处理。
做出的结果条带总是不清晰，
上样量用到80微克，
电泳条件：80U，20分钟；120U,70分钟；
转膜：PVDF,50U,70-90分钟;
一抗1：1000，
二抗：1：3000（碱性磷酸酶的）

怎么改进呢？
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1810

发表于 2013-2-23 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 flower-201 于 2013-2-23 11:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师：
我买的ABCOM的GABAAR α1 抗体，做大鼠脑组织（大脑皮层、海马、小脑），大鼠用农药处理。
做出的结果条带总是不清晰，
上样量用到80微克，
电泳条件：80U，20分钟；120U,70分钟；
转膜：PVDF,50U,70-90分钟;
一抗1：1000，
二抗：1：3000（碱 ...

用ECL方法试试
顶部
 6097  181/610 |‹‹‹179180181182183184185186187188›››|