蛋白质与蛋白组学

您好，请教下，为什么我的western做出来的图都非常难看，关键是我的marker，我重来没有看见好看的我跑的marker。。无论电流大小。都会出现marker小分子扩散，拖尾。要么就是marker被挤成原点。大分子的都还蛮漂亮。小分子的真是难看，我觉得弄得我的目的蛋白分子量都不准。请您告诉我，如何能够跑出漂亮的marker。

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用梯度胶

老师您好，再次向您请教western的问题。
我做了很长时间的western，做的蛋白分子量是92KD，一抗的推荐浓度是1：500，但是做的时候背景很高，2抗的浓度也降了一倍，但是背景还是很高，洗膜也洗了很多遍，但出来的片子背景就是黑的，想知道这是为什么。谢谢老师。

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1，一抗、二抗孵育在封闭体系中进行
2，在TBST中加入0.5M NaCl，0.2% SDS洗膜试试，这样同时也会降低目的条带的敏感性
3，继续稀释二抗做预实验
4，有些是因为一抗不太好

楼主你好，我用BCA法测定的蛋白浓度，根据标准曲线计算出来的浓度比曲线的最高值要大很多(曲线标准品的最高浓度是0.5mg/ml,计算出来的样品浓度最小的是0.85mg/ml，最大的是4mg/ml)这样得到的样品浓度是不是不准呀？

我的样品上样达到了100ug，目的蛋白一抗1：500（推荐浓度为1：1000）但是压片20分钟后条带还是不太清楚，一开始2抗1：10000，后来1：5000还是不行；国外老板用15ug就可以做出来，一抗体1：1000，虽然抗体的公司不一样但是我的这个是CST的也不差呀，他的2抗1：2000.现在很困惑，不知道下一步怎么调整！
内参做出来但是表达不太一致，是不是蛋白测定有问题的原因呀？谢谢楼主！

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BCA的标准品梯度为什么不从2mg/ml开始？
一抗CST的倒是不错，但是这里面涉及到目的蛋白的提取，你和国外老板比？
你们的系统条件一样吗？
就连最后一步在ECL的敏感性上都有很大的差别