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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-23 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下版主
我一抗加叠氮钠记错浓度；
把0.02%的叠氮钠加成0.2%
请问对实验有何影响？
有没有什么补救措施？
谢谢！

===========================

不知道你要做什么实验？
在wB中NaN3会影响HRP活性
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发表于 2013-2-23 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
试剂的配方都没有换
所用的tris-base和甘氨酸什么的都还是原来那一大瓶
跟我共用相同试剂的同学一个抗体能做出来，但beta-actin做不出来
我之前beta-actin还可以，但现在所有都做不出来

========================

beta-actin 抗体问题呢？
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发表于 2013-2-23 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
半月前刚买回来的原装santa的TGF-beta抗体，第一次做1：400非常浓，我改成1：600以后还有条带，然后就跟beta-actin一样再也没有做出来过
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发表于 2013-2-23 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，CTGF和TNF-alpha就从来都没有做出来过了
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发表于 2013-2-23 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 04906 于 2013-2-23 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

另外，CTGF和TNF-alpha就从来都没有做出来过了


在技术上应该不存在问题
你考虑抗体吧
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发表于 2013-2-23 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，请问下。为什么相同量的蛋白上样量，只有一个孔出actin，其他的不出。。相当怪异啊。。目的蛋白更是都没有。。100微克的蛋白啊。。我同在一个槽里的都出actin了。就这个4个样。。只出一个孔。。这是为什么呢？
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发表于 2013-2-23 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，请问下。为什么相同量的蛋白上样量，只有一个孔出actin，其他的不出。。相当怪异啊。。目的蛋白更是都没有。。100微克的蛋白啊。。我同在一个槽里的都出actin了。就这个4个样。。只出一个孔。。这是为什么呢？

=================

你的样品染过胶吗？
我认为是样品的问题
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发表于 2013-2-23 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的样品染过胶吗？
我认为是样品的问题

==============================================================================================================

我没染胶。。只染了膜。丽春红染的。有条带。，但是一个孔道只有一条。丽春红染色该是非特异的条带吧，就这个孔，只有一条，就一条，横的一条，其他的还有竖的宽电泳跑道，这个孔没有。其他的三个都有明显的竖的跑道，但是ACTIN就一个孔有，不是这个只有一条的孔。。这个是样品问题么？我提的样品还测了浓度的。。。
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发表于 2013-2-23 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好！

请教一下：我的目的蛋白，分子量88kD左右，分别于28，18℃诱导，裂解细胞提取上清和沉淀蛋白。
10%SDS-page，转膜恒流200mA，1.5h
5%脱脂奶粉封闭1h，一抗稀释，4℃过夜。二抗稀释1：5000，常温1.5h。

结果是marker染色了，分别是75KD和100KD，1道和4道都是mark，同样。
空白对照(BL21，Ecoli)应该没有目的条带，结果却显示清晰地一条，且和实验组的相同。

是什么原因？封闭时间不够？还是膜没有洗干净？还是其它？


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发表于 2013-2-23 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师，你好！
我最近做WB都遇到几个很苦恼的问题，请老师指教
1、几次跑电泳时到溴酚蓝距低端约2cm时几个胶道就跑成曲线了，电泳时间也很久，总共快4个小时
2、溴酚蓝弥散比较严重，条带很不好
3、有次marker在浓缩胶就分离了
4、之前怀疑电泳缓冲液的问题，今天换了新的缓冲液，还是跑斜了，并且marker跑成两个驼峰一样的，溴酚蓝弥散也比较明显，似乎也成驼峰状。今天用的缓冲液体系是，15gTris碱，72g甘氨酸，5gSDS，溶解于1L去离子水，用时稀释为1*。浓缩胶5%，分离胶12%。
图片是我之前做的一次跑斜了的，上面是目的蛋白17kd，下面是Actin，只有前半部分减到了。另一个目的蛋白P53和marker相差10kd以上，没减到。
急，请老师指教可能的原因，谢谢！
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