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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-23 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
> >我推测会不会是你配胶和凝胶有问题呢？再者，电泳的时间如果必须那么长应该降温的。当然后者不至于出来斜的。仅供参考，希望有用。
>
> 蒽，我想也是分离胶凝固的时间短了，不到一个小时，电泳时间太长后来太热是不是会把下面的分离胶给融了。
> 还有我想再请教您一下，我做的目的蛋白p53曝光时间30分钟，没做出来，actin做出来了，抗体是santa cruz兔多抗，浓度1：200，不知道是不是曝光时间不够还是怎么回事？上样量约50ug。看您在前面说p53很容易做出来，我做了几次都没做出来。。。不过曝光时间都在30分钟以内，没试过过夜曝光。
> 再次感谢您~

不必客气！其实我也是新手，观点仅供参考！一般我是配好ECL后稍震荡混匀后放在暗房中，做一下其他准备工作，约1-2分钟后在暗房孵育，关门，看到荧光后转移至保鲜膜中，开始压片。有时候是会过几分钟在保鲜膜中的荧光更亮，也可以理解，但前提是之前要见到荧光的。我一般看不到荧光是不会先曝光的。其实如果二抗的浓度合适，荧光没有那么容易淬灭的。据说如果加上ECL5s内出现荧光，说明二抗浓度过高，而且这种一般淬灭也较快。P53我没有做过，您可能看错贴了，请另外问做过的高手吧，祝好运！
关于胶会不会温度高再融我说不好，不太清楚。最好前一晚配好，在4度过夜让胶充分交联好些。个人经验，分离胶需至少常温1h后再动它，再加浓缩胶。仅供参考哈，希望有用，goodluck！
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发表于 2013-2-23 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好，今天我的内参加上发光液后立马就可以在PVDF膜上看到很明显的黄黑色条带，到暗室曝光时，条带的地方却是黑色的，曝光出来的条带是白色的，背景是黑色的，只有条带的轮廓，请帮我分析一下原因，昨天的结果还是好好的，一样的条件就是二抗孵育的时间由1小时延长到了2小时
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发表于 2013-2-23 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，请问一下：
我做的是ps1,28kd左右，刚开始几次用牛奶封闭（光明脱脂奶）做不出来，后来该用1%bsa封闭居然做出来（虽然同时加大了上样量），只是非特异带太多，看园子里战友都说两者封闭效果差不多，于是在接下来的几次里再次改用牛奶封闭（bsa太贵，而且杂带确实很多），而且上样量>=上次做出来的上样量，其他条件都没有变过。但都没有做出来，直接一片空白，
我真的想知道bsa或牛奶封闭在能不能做出来这方面起到这么大的决定作用？
谢谢！

==========================================

两者的封闭效果是有不同
有些蛋白有不同的要求，如磷酸化蛋白就需要用BSA
BSA的使用浓度要高一些，至少3%
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发表于 2013-2-23 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，我做得wb内参都出来了，目的条带有得泳道有有的泳道没有，按说应该都有的，内参都出来了，应该可以排除提蛋白得问题，我这个蛋白是提取得组织的蛋白，组织的这种目的蛋白含量应该不低得，提取过程也没什么问题得，想请教下这个可能得原因？多谢！！！

=================================

每个泳道上样量一致吗？
内参条带是不是参差不齐？
如果是这样的话浓度低的要提高上样量
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发表于 2013-2-23 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问大侠，NC膜和PVDF膜怎么使用，您能详细给我解答吗，谢谢！

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NC膜在转移缓冲液中平衡后直接使用
PVDF用无水甲醇活化10S左右，用蒸馏水洗去无水甲醇，然后在转移缓冲液中平衡后直接使用
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发表于 2013-2-23 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，今天我的内参加上发光液后立马就可以在PVDF膜上看到很明显的黄黑色条带，到暗室曝光时，条带的地方却是黑色的，曝光出来的条带是白色的，背景是黑色的，只有条带的轮廓，请帮我分析一下原因，昨天的结果还是好好的，一样的条件就是二抗孵育的时间由1小时延长到了2小时

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膜是不是没有活化好
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发表于 2013-2-23 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一直在做wb，结果是时好时坏。做xiap蛋白，好几天没有结果了，今天出了个beta-actin.但是和以前的内参结果不一样
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发表于 2013-2-23 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kulee 于 2013-2-23 17:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我一直在做wb，结果是时好时坏。做xiap蛋白，好几天没有结果了，今天出了个beta-actin.但是和以前的内参结果不一样  

样品多长时间了
中间冻融过吗
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kulee[使用道具]
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发表于 2013-2-23 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没冻融过 谢谢。谢谢
新提取的
同一个样品，不同的上样量，会出现这样的结果，是上样量太大了吗？还是1，2抗的浓度需要再调整呢？
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发表于 2013-2-23 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同一个样品，不同的上样量，会出现这样的结果，是上样量太大了吗？还是1，2抗的浓度需要再调整呢？

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从内参条带来看上样是太大了
抗原含量太高把抗体都结合完了（一抗不够）
出现部分结合不好
另外你的孵育体系是多少ml？
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