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标题:【讨论帖】western blot问题解答

ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-2-23 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问哪位前辈做过E-cadherin 呀，我最近做的E-cadherin 都是出来两个条带，重复收了几次样都是这样，不同的药物干预后也是同样的。我是从细胞里提取蛋白，用的是上海生工的RIPA强裂解液。是裂解方法的问题还是什么原因呀？请哪位前辈指点一下。非常感谢。
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发表于 2013-2-23 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的理解是：过夜一般在12h左右，时间长一些也没有关系。我试过4度孵育5天的，结果照样很好

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谢谢解答。最近内参有杂带，怀疑是一抗孕育时间过长的原因。后来减少一抗浓度，有好转。

杂带与抗体特异性、抗体浓度、抗原是否降解有关
与孵育时间不存在直接关系
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发表于 2013-2-23 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问哪位前辈做过E-cadherin 呀，我最近做的E-cadherin 都是出来两个条带，重复收了几次样都是这样，不同的药物干预后也是同样的。我是从细胞里提取蛋白，用的是上海生工的RIPA强裂解液。是裂解方法的问题还是什么原因呀？请哪位前辈指点一下。非常感谢。

==================================================

抗体不同浓度试过吗？
1，抗体特异性问题，有些抗体就是不同的特异性条带，这也正常
2，蛋白本身特点
3，抗原降解
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发表于 2013-2-23 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好：我要做WB现在找到一个单抗，种属很适合我做的（猫）但抗体没有注明应用（未注明：WB.IP等信息）我可不可以用呀？是不是一般的抗体未特殊说明的都可以做WB呀？
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发表于 2013-2-23 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢
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发表于 2013-2-23 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，最近在做分子量为190KD的蛋白，用的是10%的胶，100V电泳2小时，转膜也是100V2小时，最后没有做出来，不知道转膜时间及电流该多大，还有7.5%的胶配方知道是多少吗？请教了，谢谢
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发表于 2013-2-23 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你这个蛋白是分泌型的蛋白
做组织来源的还是细胞？

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一个尿液里提纯的，0.2mg/ml
还有就是基因工程的了，CHO分泌的

转膜的条件合适吗？

一抗会不与变性的蛋白反应吗？（如果原来做抗体的蛋白分子量与我的目的蛋白不用，因糖基化程度不同，会影响我的蛋白跟这个抗体结合？）

谢谢！
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-2-27 12:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢
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发表于 2013-2-27 12:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 nn255 于 2013-2-27 12:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢 ...

可以选择8%的胶
配制方法参考《蛋白质技术手册》或者一些网站上的资料
转膜我一般用恒流
像这个蛋白用300mA恒流，2h30min左右
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发表于 2013-2-27 12:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢

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时间你可以自己选择，时间上没有严格的限制
如果说膜蛋白丰度较大一般可以采用RIPA强配方
如果说丰度较小的话可以采用膜蛋白提取试剂盒
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