【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

guagua[使用道具]
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2011

发表于 2013-2-27 12:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做实验,总是出现好多带,就是没有目的条带,请斑主帮看下可能是什么原因啊
10%胶,上面是22KD,下面100KD的.电泳40mA,2h,转膜100V，2h，封闭5%牛奶2h，一抗（1：200，santa cruz）4度过夜，二抗（1：15000）2h,ECL发光。

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2013-2-27 12:13

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2012

发表于 2013-2-27 12:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做实验,总是出现好多带,就是没有目的条带,请斑主帮看下可能是什么原因啊
10%胶,上面是22KD,下面100KD的.电泳40mA,2h,转膜100V，2h，封闭5%牛奶2h，一抗（1：200，santa cruz）4度过夜，二抗（1：15000）2h,ECL发光。

====================

你做的是什么蛋白啊

youyou99[使用道具]
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2013

发表于 2013-2-27 12:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
黑色素瘤

===================

你做的是什么蛋白啊

============================================

是人黑色素瘤细胞的TIMP1 和 RECK (MMP的抑制因子)

tuuu2[使用道具]
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2014

发表于 2013-2-27 12:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天把上次的膜用tbst洗了一下，再加1：5000的gapdh，1h，再用tbst洗，然后ecl，拿到暗室后，发现一点荧光都没有。x胶片拿出来都没有印记的，黑色的一片。还是不知道原因~~~

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2015

发表于 2013-2-27 12:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天把上次的膜用tbst洗了一下，再加1：5000的gapdh，1h，再用tbst洗，然后ecl，拿到暗室后，发现一点荧光都没有。x胶片拿出来都没有印记的，黑色的一片。还是不知道原因~~~

==========================================================================================================

黑色的一片是你的胶片整体曝光了
造成胶片这样的原因有：1，暗室外界漏进的光太强；2，手电上的红布不合适，导致胶片走光，3，胶片过期，4，显影液与胶片不配套

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2016

发表于 2013-2-27 12:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
黑色素瘤

=============================================

是人黑色素瘤细胞的TIMP1 和 RECK (MMP的抑制因子)

========================================

1，确定二抗稀释度
2，确定后用几个不同的一抗稀释度来摸条件
3，注意膜蛋白提取方法

vcve[使用道具]
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2017

发表于 2013-2-27 12:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼主再三帮我解决问题！！我今天定了碧云天的显影剂和定影及，和ecl显影液，我用红色灯泡再试试！！！还有用立春红染色看看，再三感谢

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2018

发表于 2013-2-27 12:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2013-2-27 12:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢楼主再三帮我解决问题！！我今天定了碧云天的显影剂和定影及，和ecl显影液，我用红色灯泡再试试！！！还有用立春红染色看看，再三感谢

转膜后先用丽春红染色
再进行后续步骤

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2019

发表于 2013-2-27 12:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主您好！
最近一个新问题让我伤透了脑筋
一周之前配了一套制胶的试剂，是Tris和甘氨酸是老板新给的，Tris看样子是过期的（不认为是过期的问题，因为以前开始摸索条件时就用的是肯定过期的Tris，效果很好），甘氨酸是新的。胶凝固没有问题，40分钟之内就能凝固好，室温为15°左右。跑的时候特别慢，以前成功的经验是4%浓缩胶（大概1.5cm）60V，20多分钟就能跑到12%分离胶界面，然后压缩成一条细线，看着就高兴！
现在半个多小时过去了，也到不了分离胶的界面，时间再往后延长，MARKER能慢慢的进入分离胶，但是看不到以前的那种浓缩现象，分离范围很窄，慢是主要问题，包括所有的样品都是这个样子。电极丝上的气泡很多，估计不是电流的问题。
怀疑是丙烯酰胺的问题（已经有四个多月了），把它倒到锥形瓶内，很清凉透明，没有杂质沉淀，重新配置了（sigma粉剂没有过期），没有过滤，因为以前就是这么做的，效果很好，也验证了PH为5.5左右，小于7，合乎文章上说的；
也怀疑是调节PH时错用了冰乙酸，因此重新配置分离胶、浓缩胶和电泳液，又用盐酸调pH，盐酸浓度大概为浓盐酸的一半，pH仪来调整；
将新配的东西重新来做，慢的原因没有一点改变。
补充一点：一周之前配的胶由于跑的很慢，一个多小时后就终止了。maker慢慢的全部进入分离胶后分离的条带变少了，分子量大的由分离状态变为融合状态，而且小分子量的条带几乎就不再往下跑了。卸下玻璃板时发现分离胶又隐约分了三层，marker的带主要集中在其中的第二层，第一层也有，但是最底下的那层几乎没有marker的条带进入，不明白为什么？
如果楼主能给学生指明方向，学生不尽感激！

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2020

发表于 2013-2-27 12:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2013-2-27 12:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主您好！
最近一个新问题让我伤透了脑筋
一周之前配了一套制胶的试剂，是Tris和甘氨酸是老板新给的，Tris看样子是过期的（不认为是过期的问题，因为以前开始摸索条件时就用的是肯定过期的Tris，效果很好），甘氨酸是新的。胶凝固 ...

1，你用冰醋酸调那个试剂的pH？
2，用盐酸又是调整那个试剂？
3，我认为是你的浓缩胶与分离胶缓冲液pH的问题
4，你检查一下电泳槽的接触点

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