小中大请教大家几个问题：
1、我做的是人肿瘤细胞，钙网蛋白（calreticulin， CRT/CALR），刚开始用的是abcam的兔源多抗ab4，怎么都没有条带，投诉后换了同样是兔多抗的ab2904，条带出来了（单一且位置符合）。但是现在由于做co-IP，换了个其他实验室使用的很好的stressgen的鼠单抗，居然又没有出来（条件和他们实验室一样，甚至增加了3倍的浓度，延长孵育时间都没有），而且用的是同一张膜，先用的abcam的兔多抗,条带很强，但是由于和IgG重链没有分开，所以重新洗膜后再孵stressgen的鼠单抗，结果连阳性对照都没有出来，再用同一张膜重新孵育abcam的兔多抗，又出来了，这是什么原因呢？
2、接上面的问题，对于同一张膜，同一个蛋白使用不同的来源的抗体，条带应该在一个位置吗？
3、再接上面的问题，我的IP目的蛋白是64KDa，IgG重链是50，我现在用的是12.5%的胶，120V跑上层，80V下层跑3小时，结果由于IgG太强，掩盖了目的蛋白的信息，本来想换鼠源性的抗体来回避这个问题的，但是由于那个鼠源性的抗体一直没有出来，那只有在兔源抗体上想办法了。我除了降低IP的抗体浓度以外（厂家只说可以做IP，但是没有推荐浓度，ICC的推荐浓度是1/300，我这次做IP用的是1/100），还想通过改变下层胶的浓度是电泳时间来再将64-50两个条带拉开一些，有没有什么建议啊？有说如果电泳时间过长会使条带弥散，最长可以跑多长时间？
4、在我的试验中，两种不同的细胞A和B蛋白本来表达就有差异，如何做IP，比较这两个不同细胞中A蛋白与B蛋白结合能力的强弱呢？是不是只能靠调整上样量啊？例如在药物处理后的细胞中A蛋白的量是未处理细胞的两倍，那在做IP时，将药物处理后的细胞的蛋白量少上一半啊？有没有其他的办法啊？
5、还有一个ICC的荧光二抗的问题，我使用的是proteintech的cy3兔抗，厂家推荐是1：20-100，我稀释到1：600都有假阳性（用PBS代替一抗），用没有哪位用过该厂家的该荧光二抗啊？
