小中大请教大家几个问题:
1、我做的是人肿瘤细胞,钙网蛋白(calreticulin, CRT/CALR),刚开始用的是abcam的兔源多抗ab4,怎么都没有条带,投诉后换了同样是兔多抗的ab2904,条带出来了(单一且位置符合)。但是现在由于做IP,换了个其他实验室使用的很好的stressgen的鼠单抗,居然又没有出来(条件和他们实验室一样,甚至增加了3倍的浓度,延长孵育时间都没有),而且用的是同一张膜,先用的abcam的兔多抗,条带很强,但是由于和IgG重链没有分开,所以重新洗膜后再孵stressgen的鼠单抗,结果连阳性对照都没有出来,再用同一张膜重新孵育abcam的兔多抗,又出来了,这是什么原因呢?
2、接上面的问题,对于同一张膜,同一个蛋白使用不同的来源的抗体,条带应该在一个位置吗?
3、再接上面的问题,我的IP目的蛋白是64KDa,IgG重链是50,我现在用的是12.5%的胶,120V跑上层,80V下层跑3小时,结果由于IgG太强,掩盖了目的蛋白的信息,本来想换鼠源性的抗体来回避这个问题的,但是由于那个鼠源性的抗体一直没有出来,那只有在兔源抗体上想办法了。我除了降低IP的抗体浓度以外(厂家只说可以做IP,但是没有推荐浓度,ICC的推荐浓度是1/300,我这次做IP用的是1/100),还想通过改变下层胶的浓度是电泳时间来再将64-50两个条带拉开一些,有没有什么建议啊?有说如果电泳时间过长会使条带弥散,最长可以跑多长时间?
4、在我的试验中,两种不同的细胞A和B蛋白本来表达就有差异,如何做IP,比较这两个不同细胞中A蛋白与B蛋白结合能力的强弱呢?是不是只能靠调整上样量啊?例如在药物处理后的细胞中A蛋白的量是未处理细胞的两倍,那在做IP时,将药物处理后的细胞的蛋白量少上一半啊?有没有其他的办法啊?
5、还有一个ICC的荧光二抗的问题,我使用的是proteintech的cy3兔抗,厂家推荐是1:20-100,我稀释到1:600都有假阳性(用PBS代替一抗),用没有哪位用过该厂家的该荧光二抗啊?
你的问题我不是很明白
不好意思
你为什么不用WB试试?
不好意思是co-IP。漏写了,我是想做CRT和另一个分子伴侣的相互作用。请指教!