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标题:【讨论帖】western blot问题解答

loli[使用道具]
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发表于 2013-3-2 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主您好，我刚准备做WB，我的目的蛋白22KD，想请教一下配胶的浓度，跑胶时间电压，以及半干转转膜条件，还有该怎么样摸一抗二抗浓度呢，谢谢，问题有点弱，还是希望您能详细说说，谢谢
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发表于 2013-3-2 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 loli 于 2013-3-2 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主您好，我刚准备做WB，我的目的蛋白22KD，想请教一下配胶的浓度，跑胶时间电压，以及半干转转膜条件，还有该怎么样摸一抗二抗浓度呢，谢谢，问题有点弱，还是希望您能详细说说，谢谢 ...

要说的东西太多了。。。。。。
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发表于 2013-3-2 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-3-2 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


要说的东西太多了。。。。。。

不好意思，问题太多了，学习了楼主先前的帖子，现我把问题再具体些，劳烦楼主给解答一下
1，我们实验室跑胶现用70V+100V,用于我的目的蛋白22K可以吗，
2，22KD的话膜用0.45还是0.22呢
3,转膜1.2mA每平方厘米,该转多少时间呢
4,楼主说先点杂交摸二抗浓度,是不是说封闭后洗膜,不加一抗,将不同浓度二抗点在膜上,待膜干后用ECL显影
谢谢
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发表于 2013-3-2 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 loli 于 2013-3-2 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


不好意思，问题太多了，学习了楼主先前的帖子，现我把问题再具体些，劳烦楼主给解答一下
1，我们实验室跑胶现用70V+100V,用于我的目的蛋白22K可以吗，
2，22KD的话膜用0.45还是0.22呢
3,转膜1.2mA每平方厘米,该转多少时间呢
4,楼 ...

1，可以用90V，溴酚蓝跑到分离胶调整电压150V
2，两种膜都可以用
3，转膜1.2mA每平方厘米，恒流，30min~40min
4，二抗点膜的话在干的NC膜上直接点稀释好的二抗，不用封闭等。在室温干燥后直接用ECL曝光，显影
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2013-3-2 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

斑竹，请问转完膜之后的PVDF膜在封闭液中4度封闭一周还能再接着用吗？
O(∩_∩)O谢谢
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发表于 2013-3-2 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 bamboo16 于 2013-3-2 09:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

斑竹，请问转完膜之后的PVDF膜在封闭液中4度封闭一周还能再接着用吗？
O(∩_∩)O谢谢

看奶粉长菌、结块没有
如果没有肯定没问题
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发表于 2013-3-2 09:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近做一对不同样本中目的蛋白的定量比较，杂了b-actin后发现很难保证上样量相同，我是一块胶同样的一对样品重复上样(40ug)，结果两两比较时actin一会高一会低，请问对于这种定量比较实验，老师有什么好的经验可以传授一二？比如备样，上样，转膜和曝光，其中有哪些要特别注意？O(∩_∩)O谢谢
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发表于 2013-3-2 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做western也做了好多次了，也算是初学者。有几次转膜完的时候发现胶条变皱了一个角，像是在空气中氧化的那样，是什么原因呢？是因为有气泡的原因吗？怎么样才能知道气泡都赶干净啦？每次我都赶好几遍的，可是还是会这样，真是愁人。希望帮忙解答一下
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发表于 2013-3-2 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问我要检测血清里的蛋白，蛋白浓度有什么要求吗
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jkobn[使用道具]
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发表于 2013-3-2 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
伯乐半干转膜仪，伯乐PVDF膜，转移缓冲液配方（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）：
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml

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我有2个目的蛋白，分别是110kD和130kD，用上述仪器和试剂，麻烦楼主推荐个转膜条件。
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