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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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请问版主有没有做过p-eNOS?乙酰胆碱可以用来做刺激剂吗?我反复做都做不出来,总蛋白和内参都做得出来,磷酸酶抑制剂也加了,谢谢!

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不好意思哈
我只做过WB方面的实验
对乙酰胆碱有关的实验设计没有涉及过
总蛋白与内参都做的出来的话,现在的情况如下
1、换一抗
2、磷酸化蛋白可能较少,需要用更加灵敏的ECL
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谢谢老师指点,那我换换marker试试。另外还想请教一个问题,我的跑胶时间过长,一般积层胶用60-70v*1小时,分离胶100V*4-5小时甚至跑过7小时的,但溴酚蓝仍未跑至底线,且17-10KD的marker也没跑开,隐于溴酚蓝中,每次的电泳缓冲液都是新鲜配制同时也注意了降温,想请教老师跑胶跑不开,电泳时间过长应该还考虑哪些方面的影响呢?电泳时间长对WB有何影响?

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电泳可以采用90V,溴酚蓝进入分离胶采用150~180V
你跑这么长时间的电泳竟然没有到底?
pH有问题
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非常感谢您的指导!因为是刚开始做所以不太懂,谢谢您的细致解释!我的蛋白是38kDa的。十二孔板直接加裂解液裂解多久呢,30分钟还是5分钟,要用细胞刮么?

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1、38K的蛋白可以选用beta-tubulin作为内参
2、12孔板具体加裂解液的量我不是很懂,你告诉我细胞计数量,我可以告诉你加多少裂解液
3、直接加裂解液你可以看到细胞从壁上掉下来,2min左右,把它们收集到EP管中,放置在冰上孵育20min,期间需要振荡几次
4、不需要细胞刮
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kuaizige[使用道具]
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1、分子量怎么不标上呢
我已经标出分子量了。

2、你用的什么Marker?
我们用的Bio-Rad的Precision Plus Protein standards(双色)marker,共8条带,从250-10 kDa,转膜后可以看到marker都转到膜上了,但在杂交洗膜过程中,marker颜色强度逐渐减弱,曝光后在X胶片上只出来两条带。

3、不同的marker在不同的胶浓度里表现是不一样的
我们的浓缩胶是3%,分离胶是12%(采用如下单体贮液:丙烯酰胺19.55g,甲叉0.45 g,定容到50 ml)

这两天换不同样品杂交,还是出来这两条带,当时公司给我一抗的时候,纯化出来的蛋白分子量是26 kDa,现在我们杂交出来的条带差10 kDa,杂交结果可否用呢,出现这样的情况是啥原因呢?多谢版主了。

你检测的是纯化后的蛋白还是内源性蛋白?
有可能是你的目的条带降解了

我检测的是从香蕉果实里面提出来的总蛋白,采用酚抽提法提取的。我100毫安转了5 h,是不是转得时间太长了导致目的条带降解?我如何来避免目的条带降解呢?
多谢版主!
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蛋白降解主要在蛋白提取的过程中
我没做过用酚抽提蛋白
不能给你建议
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987789[使用道具]
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我在做ERK磷酸化的WB.一抗是cell signaling的,稀释度按照他的说明书1:2000稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给点建议,谢谢。
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QUOTE:
原帖由 987789 于 2013-3-2 12:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在做ERK磷酸化的WB.一抗是cell signaling的,稀释度按照他的说明书1:2000稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给 ...

1、检查TBST等的pH
2、不要重复使用抗体多次
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斑竹,您好!非常感谢您的解答。我现在还是把我整个western blot 的过程写一下:
首先我的目的蛋白是分子量为55kDa.5%的浓缩胶,10%的分离胶。电泳在浓缩胶是80v。到分离胶是150v。湿转100mA 100分钟。5%的脱脂奶粉室温2-3小时。一抗4度过夜,洗膜 二抗37度一小时 洗膜 加发光液 显影 谢谢 我的整个这个可合适,因为一直都没做出来。谢谢
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看了您的WB经验后,很受启发,先感谢您的无私分享。
我现在也在做WB,我的内参b-actin(42KD)做的相当好,但是我的目的蛋白FAK(125KD)、phospho-FAK(125KD)的都没有做出来。我用的细胞分别为Hela及NIH3T3细胞 细胞数量为100万左右,收集细胞后,直接用国内公司的RIPA试剂加PSMF裂解。经考染后,发现总体蛋白条带不是很亮,特别是100KD以上的,我想是不是因为国产的RIPA的效果不大好,细胞蛋白的提量太少了?想请教您:您用的是国产还是进口的RIPA,或是自己配制的?效果如何?可否给点建议。谢谢先。
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dongdongqiang[使用道具]
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我还怀疑是不是自己操作出问题,我就是按试剂说明书操作的:1.100万细胞加200ul的RIPA buffer现加2ul的PMSF;2.吹打细胞,冰浴20min;3.4度,12000转离心10min,收集上清到新管。没感觉自己出了什么问题,为什么我的细胞目的蛋白就那么少呢?
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