蛋白质与蛋白组学

请问，第一次做，我有三个蛋白要做WB，一个是28kD、57kD、130KD，请问可在同一条件下跑胶，及胶的浓度？转膜的时候条件是什么？时间，电压等，谢谢！

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还是分开做吧

检测磷酸化p38蛋白表达量的，分子量38kDa,电泳浓缩胶80v，分离胶150v；转膜可以恒流多大及多长时间比较合适呢？

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恒流 湿转 300mA 1h

这张膜对应的胶，我们也进行考染了，结果请看附件

我们想问的问题是：1 从第一张图片来看，我们转膜过程存在什么样的问题，可能的原因在哪？有什么建议吗（我们用的是Invitrogen 4%-12%的预制胶） 2 第二张图上，100KD底下的那条带是不是目的蛋白p-P70呢？条带斑驳的原因会不会是蛋白转的不好呢?

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感觉蛋白处理的不好

我是一名新手，做大鼠海马钙调蛋白，内源性的，分子量：16.7kd，版主建议用0.22um孔径膜，是不是用0.45的就做不出结果？另外劳烦版主给一点转膜（湿转）的建议。谢谢

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0.45um的膜不容易截留16.7K的蛋白
湿转300mA，0.22um膜，30min

上次请教的问题还没得到版主的回答，今天又出现啦。请版主 百忙中给指教一下：
遇到个古怪的情况，郁闷好几天了，请教下高人。蛋白64kd，电泳没什么问题，上样量也算过了40~60ug，跑完marker很清楚。之后转膜，安装没问题，电转液没问题，270mA，70min之后，膜上染色没条带，胶染过没条带，连marker都不见了。有什么地方可能会有问题呢？

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用什么染膜的？
正负极没问题？
在转膜之前SDS-PAGE胶染过吗？

那我现在的整个流程没有问题吧？
另外，我还有个问题想请教一下，我们用的是冠龙牌的显影粉，单蒸水配的，放在棕色瓶里保存，倒出来时还是淡黄色的，可用一次就变成棕黄色了，不知道是天冷的缘故还是为什么，想问一下一般啥牌子的显影液比较好。

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显影粉没有太大影响
只要型号对就行
我是用自来水配制的，好像是天津一公司生产的
变黄色不是天冷的缘故，而是氧化了
用完后用密封的东西保存可以重复用多次

做两个分子量21KD，30KD的蛋白，12%的分离胶，120V，5%浓缩胶，60V，用BIO-BAD半干转膜，10-15V 15-30Min 都试过了，丽春红染色，膜上蛋白印迹较淡，抗体标记后未见目的蛋白条带，同一块胶上的B-Actin曝光较理想，请教目的蛋白的转膜条件？还是抗体的问题？？一抗是兔抗大鼠的BIOWorld5UL试用装抗体，二抗是中衫的山羊抗兔，浓度均是按照说明书上推荐的最大浓度，年底想赶紧把实验结束掉......特此请教！多谢！！

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如果让我选择的话
转膜条件我会选择：半干 1.2mA/平方厘米膜面积，1h
目的蛋白是和谁呢么？